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(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102888431A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102888431A(43)申请公布日2013.01.23(21)申请号201110202325.4(22)申请日2011.07.19(71)申请人陈依军地址215002江苏省苏州市养育巷瓣莲巷42号4幢104室(72)发明人陈依军江金鹏吴旭日(74)专利代理机构苏州创元专利商标事务所有限公司32103代理人陶海锋(51)Int.Cl.C12P13/04(2006.01)权利要求书权利要求书1页1页说明书说明书77页页附图附图22页(54)发明名称一种制备L-叔亮氨酸的方法(57)摘要本发明公开了一种以亮氨酸脱氢酶为生物催化剂制备单一光学纯L-叔亮氨酸的工艺方法,具体包括以下步骤:在反应液中加入底物三甲基丙酮酸、甲酸铵、亮氨酸脱氢酶和由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系,振荡或搅动,反应后加热反应体系,过滤或离心除去变性蛋白,除去溶剂,过滤后,得到L-叔亮氨酸产物和含有少量L-叔亮氨酸的滤液,滤液循环用于下一轮反应,反应温度为15~50℃。本发明利用亮氨酸脱氢酶,配合辅酶循环再生体系,采用循环工艺制备L-叔亮氨酸,底物浓度高达2.0M,所需的辅酶NAD+或NADH浓度较低,并且可循环多次使用而达到忽略辅酶成本的水平,具有重要应用价值。CN102843ACN102888431A权利要求书1/1页1.一种制备L-叔亮氨酸的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)向反应液中加入底物三甲基丙酮酸、共底物甲酸铵、亮氨酸脱氢酶以及由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系,配制得到反应体系;所述反应液为水或pH7.0~10.0的缓冲液;底物浓度为1.0M~2.0M;所述共底物甲酸铵和底物三甲基丙酮酸的摩尔比为1∶1~10∶1;所述亮氨酸脱氢酶的浓度大于或等于2U/mL,亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶摩尔比为1∶1~1∶5;所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系中NAD+或NADH的浓度大于或等于0.01mM;(2)步骤(1)所得反应体系在振荡或搅拌条件下,调节反应体系pH至7.0~10.0,于15~50℃下,反应制备L-叔亮氨酸。2.根据权利要求1所述制备L-叔亮氨酸的方法,其特征在于,步骤(2)中,在保持反应进行的同时,补加底物三甲基丙酮酸;补加底物的方式选自:一次性加入底物或分批加入底物或连续加入底物中的一种;并且保持反应体系中的底物浓度小于或等于2.0M。3.根据权利要求1所述制备L-叔亮氨酸的方法,其特征在于,所述制备L-叔亮氨酸的方法还包括:步骤(2)反应完成后将反应液于50~100℃下加热,使蛋白变性,离心或过滤除去变性蛋白,除溶剂后,经过滤,得到L-叔亮氨酸产物和含有少量L-叔亮氨酸的滤液。4.根据权利要求3所述制备L-叔亮氨酸的方法,其特征在于,所述制备L-叔亮氨酸的方法还包括:循环利用滤液,向滤液中补加三甲基丙酮酸、甲酸铵、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶,构成与步骤(1)相同的反应体系;调节反应体系溶液pH至7.0~10.0,振荡或搅拌,于15~50℃下,反应3~24小时,制备L-叔亮氨酸,重复该步骤直至转化率低于95%。5.根据权利要求1所述制备L-叔亮氨酸的方法,其特征在于,所述pH7.0~10.0的缓冲液为甲酸铵-氨水缓冲液、氯化铵-氨水缓冲液、Tris-HCl缓冲液或硼酸缓冲液。2CN102888431A说明书1/7页一种制备L-叔亮氨酸的方法技术领域[0001]本发明属于手性医药中间体制备领域,涉及一种生物催化法不对称制备手性医药中间体的方法,具体涉及一种以三甲基丙酮酸为底物,以亮氨酸脱氢酶为生物催化剂,实现单一光学纯度的L-叔亮氨酸高效制备的工艺方法。背景技术[0002]L-叔亮氨酸,即L-2-氨基-3,3-二甲基丁酸,分子式为C6H13NO2,分子量为131.17,CAS号为20859-02-3。L-叔亮氨酸是一种非蛋白源的手性氨基酸,由于疏水性叔丁基侧链具有较大空间位阻,在化合物的合成中它能够很好地控制分子构象,因此,该氨基酸作为一种重要的医药中间体,被广泛用于合成生物抑制剂、生物活性肽、抗癌和抗病毒等药物,例如百时美-施贵宝公司2009年销售额就达到14亿美金的抗HIV药物阿扎他韦;以L-叔亮氨酸作为医药中间体合成的抗丙型肝炎病毒药物博赛普韦、特拉普韦,已经完成了临床研究并于2011年上市;另一些从L-叔亮氨酸合成的抗丙型肝炎病毒药物BI201335,narlaprevir,vaniprevir以及BMS791325,也都进入了二期临床研究。因此,预计今后医药行业对L-叔亮氨酸的需求量将呈现逐年上升的趋势。[0003]传统的合成医药中间体L-叔亮氨酸的方法为化学方法,包括化学拆分法和化学不对称合成法。前者利用手性拆分试剂对