生产L‑亮氨酸菌株和生产L‑亮氨酸的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106754807A(43)申请公布日2017.05.31(21)申请号201611248621.7C12N1/21(2006.01)(22)申请日2016.12.29C12P13/06(2006.01)C12R1/15(2006.01)(83)生物保藏信息CGMCCNO.134082016.11.30(71)申请人廊坊梅花生物技术开发有限公司地址065001河北省廊坊市开发区华祥路66号(72)发明人常静胡丹程江红刁刘洋毛贤军(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人赵青朵(51)Int.Cl.C12N9/10(2006.01)权利要求书1页说明书7页C12N15/54(2006.01)序列表8页(54)发明名称生产L-亮氨酸菌株和生产L-亮氨酸的方法(57)摘要本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及生产L-亮氨酸菌株和生产L-亮氨酸的方法。本发明以紫外线和亚硝基胍对谷氨酸棒杆菌进行诱变，获得了两个有利于L-亮氨酸产生的关键突变leuAG561D和ilvBG235S，研究表明，leuAG561D和/或ilvBG235S突变条件下，L-亮氨酸的合成途径中的反馈抑制被解除，L-亮氨酸的产量得到大幅提高，获得了能够大量产生L-亮氨酸的菌株，保藏编号为CGMCCNO.13408，该菌株能够实现发酵过程中L-亮氨酸的高效积累，L-亮氨酸可达4.7g/L。CN106754807ACN106754807A权利要求书1/1页1.突变的leuA蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.编码权利要求1所述突变的leuA蛋白的DNA分子。3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。4.突变的ilvB蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。5.编码权利要求4所述突变的ilvB蛋白的DNA分子。6.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。7.一种重组菌株，其特征在于，表达权利要求2或3所述的DNA分子。8.一种重组菌株，其特征在于，表达权利要求5或6所述的DNA分子。9.一种重组菌株，其特征在于，表达权利要求2或3所述的DNA分子，且表达权利要求5或6所述的DNA分子。10.根据权利要求7～9任一项所述的重组菌株，其特征在于，其起始菌株为谷氨酸棒杆菌。11.根据权利要求9所述的重组菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNO.13408。12.权利要求7～11任一项所述的重组菌株在生产L-亮氨酸中的应用。13.一种生产L-亮氨酸的方法，其特征在于，发酵权利要求7～11任一项所述的重组菌株。14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为33℃、摇床110rpm，发酵培养基包括：2CN106754807A说明书1/7页生产L-亮氨酸菌株和生产L-亮氨酸的方法技术领域[0001]本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及生产L-亮氨酸菌株和生产L-亮氨酸的方法。背景技术[0002]L-亮氨酸即α-氨基-γ-甲基戊酸或α-氨基异己酸，属于支链氨基酸，是人体必须依赖外源供给的八大必需氨基酸之一。L-亮氨酸是亮氨酸的左旋体，在医药、食品、化妆品、及饲料等行业中具有非常广泛的应用。[0003]在L-亮氨酸的生产中常用提取法、化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。其中，微生物发酵法以其环保、条件温和、质量稳定等优点成为L-亮氨酸生产的主要方法。在L-亮氨酸生产行业中日本企业占主导地位，尤其是日本味之素公司，其在亮氨酸生产中具有非常明显的优势。[0004]目前，随着生物学的不断发展进步，L-亮氨酸在棒杆菌属中的生物合成途径及其调控机制已掌握清楚。谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13869基因组测序的完成及谷氨酸棒杆菌基因操作技术的不断完善，使得通过基因工程手段对谷氨酸棒杆菌进行改造成为现实。研究表明，在L-亮氨酸的合成途径中，存在多个关键酶，其中，leuA编码α-异丙基苹果酸合酶，催化α-酮异戊酸合成α-异丙基苹果酸，是L-亮氨酸合成途径的关键酶，受终产物L-亮氨酸的反馈抑制。ilvBN编码乙酰羟酸合酶，受L-亮氨酸、L-缬氨酸及L-异亮氨酸的反馈抑制，其中ilvB编码乙酰羟酸合酶的大亚基，起催化作用。解除反馈抑制有助于提高L-亮氨酸等支链氨基酸的产量。现有的亮氨酸生物合成菌株和方法已经逐渐不能满足日益加大的市场需求，因此，利用生物工程方法，进一步开发能够大量生成亮氨酸的菌株和生产方法成为了研究的热点。发明内容[0005]有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供生产L-亮氨酸菌株和生产L-亮氨酸的方法，本发明提供的菌株产亮氨酸的量可达4.7g/L。[0006]本发明提供了突变