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(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114634955A(43)申请公布日2022.06.17(21)申请号202210431124.XC12N9/06(2006.01)(22)申请日2022.04.22C12N15/70(2006.01)A61P31/12(2006.01)(71)申请人金达威生物技术(江苏)有限公司C12R1/19(2006.01)地址226200江苏省南通市启东市生命健康科技园金科路899号16幢1-4层面申请人内蒙古金达威药业有限公司南京桦冠生物技术有限公司(72)发明人祝俊徐飞王苓何宝亮李丹李斌陈剑余长泉(74)专利代理机构北京品源专利代理有限公司11332专利代理师陈小龙(51)Int.Cl.C12P13/04(2006.01)C12N9/04(2006.01)权利要求书3页说明书14页序列表3页附图1页(54)发明名称一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法及其应用(57)摘要本发明提供了一种生物酶催化制备L‑叔亮氨酸的方法及其应用。所述生物酶催化制备L‑叔亮氨酸的方法包括如下步骤:以2‑羟基‑3,3‑二甲基丁酸为底物,在2‑羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的催化下反应得到L‑叔亮氨酸。本发明采用三甲基丙酮酸的前体2‑羟基‑3,3‑二甲基丁酸作为底物,用筛选出的特异性的2‑羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶偶联反应,实现了辅酶NADH自循环,节约了成本;三甲基丙酮酸生成后就被L‑亮氨酸脱氢酶转化成L‑叔亮氨酸,不会存在底物抑制。所述生物酶催化制备L‑叔亮氨酸的方法具有操作简单、无需添加额外NADH、收率高和生产成本低等优势,环保安全、绿色无污染,在工业生产上具有广阔的应用前景。CN114634955ACN114634955A权利要求书1/3页1.一种生物酶催化制备L‑叔亮氨酸的方法,其特征在于,所述生物酶催化制备L‑叔亮氨酸的方法包括如下步骤:以2‑羟基‑3,3‑二甲基丁酸为底物,在2‑羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的催化下反应得到L‑叔亮氨酸。2.根据权利要求1所述的生物酶催化制备L‑叔亮氨酸的方法,其特征在于,所述2‑羟基酸脱氢酶包括D‑2‑羟基酸脱氢酶和L‑2‑羟基酸脱氢酶;优选地,所述D‑2‑羟基酸脱氢酶的编码基因包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列;优选地,所述L‑2‑羟基酸脱氢酶的编码基因包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列;优选地,所述亮氨酸脱氢酶包括L‑亮氨酸脱氢酶;优选地,所述L‑亮氨酸脱氢酶的编码基因包括SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的生物酶催化制备L‑叔亮氨酸的方法,其特征在于,所述生物催化反应包括如下步骤:将2‑羟基‑3,3‑二甲基丁酸、氨基供体和水混合,加热升温,调节反应液的pH,加入2‑羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉和NAD+,进行生物催化反应;优选地,所述2‑羟基‑3,3‑二甲基丁酸、氨基供体和水混合的质量比为(1.3~1.5):(0.8~1.5):(20~40);优选地,所述氨基供体包括硫酸铵;优选地,所述加热的温度为38~42℃;优选地,采用pH调节剂调节反应液的pH为8.5~9.5;优选地,所述pH调节剂包括氨水;优选地,所述2‑羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的添加量占反应液总质量的0.2~0.4%;优选地,所述NAD+的添加量占反应液总质量的0.3~0.8%;优选地,所述生物催化反应的温度为35~40℃,所述生物催化反应的时间为1~4h。4.根据权利要求1~3中任一项所述的生物酶催化制备L‑叔亮氨酸的方法,其特征在于,所述2‑羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的制备方法包括如下步骤:(1)制备表达D‑2‑羟基酸脱氢酶、L‑2‑羟基酸脱氢酶和L‑亮氨酸脱氢酶的共表达载体,将共表达载体导入底盘细胞中,得到基因工程菌;(2)将步骤(1)所得基因工程菌进行发酵培养得到菌体;(3)将步骤(2)所得菌体制成2‑羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉。5.根据权利要求4所述的生物酶催化制备L‑叔亮氨酸的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述基因工程菌的制备方法包括如下步骤:合成编码D‑2‑羟基酸脱氢酶与L‑亮氨酸脱氢酶的基因片段a,合成编码L‑2‑羟基酸脱氢酶与L‑亮氨酸脱氢酶的基因片段b;将基因片段a和基因片段b克隆至表达载体上,获得共表达载体,将共表达载体导入底盘细胞中,得到基因工程菌;优选地,所述基因片段a中还包括RBS序列;优选地,所述基因片段b中还包括RBS序列;优选地,所述RBS序列包括SEQIDNO.4~6所示的核苷酸序列中任意一种;2CN114634955A权利要求书2/3页优选地,所述表达载体包括pRSFDuet1质粒;优选地,所述底盘细胞包括大肠杆菌。6.根据权利要求4或5所述的生物酶催化制备L‑叔亮氨