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本发明属于抗体制备技术领域,尤其涉及一种单链抗体扩展库的制备方法及其应用。本发明以CHO上清HCP蛋白混合物整体作为蛋白抗原进行兔免疫制备抗体文库,在抗体文库中,重链或轻链可变区存在多个引物对,分别将H链,或者κ或λ的各自多组F/R引物对集中到一起进行扩增,得到多于常规库容量的重链或轻链组,拼接成非天然单链抗体,体外表达非天然重组抗体扩展库,相较血清来源抗体对抗原的识别能力高,结合多重PCR技术可以无限量制备稳定的抗体扩展库,减少时间、物料投入,制备方便。