基因工程目的基因的制备.ppt

（优选）基因工程目的基因的制备第一节目的基因的制备
一、直接分离法
1、限制性核酸内切酶酶切分离法
已知序列基因.
酶切后分离
与适当载体重组
转入受体。2、物理化学法
密度梯度离心法：不同大小的DNA被分开，再用探针杂交检验。
单链酶解法：GC间三键，AT间双键，适当温度解开AT多的链，GC多的链未解开，用单链酶降解单链，剩下GC链。
分子杂交法：利用探针分子通过分子杂交固定相关基因。
是基因在发展初期所用的方法
3、双抗体免疫法
蛋白质已分离纯化，并制备了它的抗体1。
mRNA合成蛋白质时与核糖体蛋白质结合形成聚合体。
分离这种蛋白质聚合体，与制备好的抗体1进行免疫反应。再加入抗体1的抗体进行免疫反应。
分离这种反应产物，再去除蛋白质，剩下mRNA，反转录后合成cDNA。去蛋白提取RNA，反转录合成cDNA二构建基因组文库1、基因文库的概念2、基因文库的大小3、构建λ噬菌体基因组文库的步骤切割方法：
物理学方法：机械力和超声波。
生物化学法：酶切
为满足切割的随机性，一般采用识别序列为4bp的限制酶。
如Sau3AI或MboI等切后的片段可直接与BamHI酶切的载体连接。
切割后通过凝胶电泳或密度梯度离心，回收一定大小范围的DNA片段。与λ噬菌体克隆载体连接重组。
噬菌体载体的酶切：
两臂与中央片段相连处有SalI,BamHI和EcoRI酶切位点。两臂中原有的酶切位点被除去。
采纳BamHI，因为该酶切产生的粘性末端与Sau3AI或MboI切割末端结构一样，采用Sau3AI或MboI酶解产生的DNA片段可直接与噬菌体的BamHI酶切位点连接。
BamHI切割载体后，电泳或离心将两臂与中央片段分离，回收两臂。在T4DNA连接酶的作用下载体两臂与外源DNA片段连接。14/31（1）、用Cosmid作载体构建基因组文库的优点：
可容纳更大片段（30-45kb），文库中所需克隆数少。
载体本身的分子很小，一般只有5kb，便于直接分析插入片段的酶切图谱。YAC：酵母人工染色体
适合克隆长达数百kb的大片段。
常用的YAC载体为pYAC4。
首先，用BamHIEcoRI双酶切载体，形成双臂，回收两臂。
其次，制备生物完成DNA，用低浓度EcoRI部分消化，纯化后与YAC连接。
然后转化去壁的酵母细胞，并进行筛选。
23/31基因组很大，有重复序列和非编码序列。
通常表达基因占15%，产生约15000种mRNA。
从mRNA分离目的基因更容易。
可把mRNA反转录成cDNA，构建cDNA文库，从中分离目的基因。1、cDNA基因文库的概念（2）、缺点：
只反映mRNA所携带的信息。不能反映内含子、启动子和终止子及核糖体识别mRNA相应的序列。
只包含特定组织、特定发育阶段的基因。（3）、优点：
A、mRNA为材料，特别适用于RNA病毒。
B、克隆数少，筛选比较简单。
C、假阳性出现概率小。出现假阳性则有意义，可证明其它片段上也出现该基因序列。
D、cDNA中无内含子序列可适用于原核生物的直接转化入表达。
F、通过与基因组DNA文库比较，可用于分析真核基因结构、组织和表达。2、cDNA文库的构建（1）、分离细胞总RNA，纯化出mRNA。
tRNA、rRNA和mRNA
mRNA占总RNA的1-5%，种类繁多，分子大小不一。
显著特征：3`端有poly(A)。
用Oligo(dT）结合在纤维素柱上，带poly(A)的mRNA可结合在柱上，而其它RNA则不能，从而使其与其它RNA分开。（2）、以mRNA分子为模板合成cDNA第一链：
以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，利用适当的引物合成的。
引物：
oligo(dT)引物：从3`端开始，适于较短的mRNA。
随机引物：在mRNA的任何位置开始，适于较长的mRNA。（3）、双链cDNA的合成：
A、自我引导合成：
用碱处理使mRNA-DNA杂交分子中的mRNA降解，cDNA第一链解离，单链cDNA3`端自身环化，形成一个发夹环结构。在DNA聚合酶的作用下产生一个完整的发夹结构双链cDNA，S1核酸酶将发夹切去，即可。
缺点：S1酶会多切，而丢失信息。AAAAAAAAAAD、PCR法：AAAAA（4）、将cDNA双链重组到质粒或噬菌体上导入大肠杆菌宿主细胞。
A、标准方法将cDNA甲基化。防酶切
B、末端转移酶加尾或加适当的衔接头与适当方法处理的载体连接。
C、将重组DNA转化大肠杆菌宿主。
常用的载体是λgt10/λgt101，一般不用转化效率低的质粒。AAAAAA表达型cDNA文库的构建演示243、mRNA丰度与cDNA文库大小经验值是理论值的4.5倍左右四、利用PCR扩增目的基因1、套式PCR
两对引物扩增同一样品的方法。从一个DNA模板的同一区域扩增出不同长度的片段而设计。2、反向PCR3