基因工程目的基因的制备ppt课件.ppt

6学时教学重点：基因组文库、cDNA文库及筛选文库方法的原理及操作规程。第一节目的基因的制备第二节目的基因的分离第一节目的基因的制备一、直接分离法1、限制性核酸内切酶酶切分离法已知序列基因.酶切后分离与适当载体重组转入受体。2、物理化学法密度梯度离心法：不同大小的DNA被分开，再用探针杂交检验。单链酶解法：GC间三键，AT间双键，适当温度解开AT多的链，GC多的链未解开，用单链酶降解单链，剩下GC链。分子杂交法：利用探针分子通过分子杂交固定相关基因。是基因在发展初期所用的方法3、双抗体免疫法蛋白质已分离纯化，并制备了它的抗体1。mRNA合成蛋白质时与核糖体蛋白质结合形成聚合体。分离这种蛋白质聚合体，与制备好的抗体1进行免疫反应。再加入抗体1的抗体进行免疫反应。分离这种反应产物，再去除蛋白质，剩下mRNA，反转录后合成cDNA。去蛋白提取RNA，反转录合成cDNA二构建基因组文库1、基因文库的概念2、基因文库的大小3、构建λ噬菌体基因组文库的步骤切割方法：物理学方法：机械力和超声波。生物化学法：酶切为满足切割的随机性，一般采用识别序列为4bp的限制酶。如Sau3AI或MboI等切后的片段可直接与BamHI酶切的载体连接。切割后通过凝胶电泳或密度梯度离心，回收一定大小范围的DNA片段。与λ噬菌体克隆载体连接重组。噬菌体载体的酶切：两臂与中央片段相连处有SalI,BamHI和EcoRI酶切位点。两臂中原有的酶切位点被除去。采纳BamHI，因为该酶切产生的粘性末端与Sau3AI或MboI切割末端结构一样，采用Sau3AI或MboI酶解产生的DNA片段可直接与噬菌体的BamHI酶切位点连接。BamHI切割载体后，电泳或离心将两臂与中央片段分离，回收两臂。在T4DNA连接酶的作用下载体两臂与外源DNA片段连接。14/31（1）、用Cosmid作载体构建基因组文库的优点：可容纳更大片段（30-45kb），文库中所需克隆数少。载体本身的分子很小，一般只有5kb，便于直接分析插入片段的酶切图谱。YAC：酵母人工染色体适合克隆长达数百kb的大片段。常用的YAC载体为pYAC4。首先，用BamHIEcoRI双酶切载体，形成双臂，回收两臂。其次，制备生物完成DNA，用低浓度EcoRI部分消化，纯化后与YAC连接。然后转化去壁的酵母细胞，并进行筛选。23/31基因组很大，有重复序列和非编码序列。通常表达基因占15%，产生约15000种mRNA。从mRNA分离目的基因更容易。可把mRNA反转录成cDNA，构建cDNA文库，从中分离目的基因。1、cDNA基因文库的概念（2）、缺点：只反映mRNA所携带的信息。不能反映内含子、启动子和终止子及核糖体识别mRNA相应的序列。只包含特定组织、特定发育阶段的基因。（3）、优点：A、mRNA为材料，特别适用于RNA病毒。B、克隆数少，筛选比较简单。C、假阳性出现概率小。出现假阳性则有意义，可证明其它片段上也出现该基因序列。D、cDNA中无内含子序列可适用于原核生物的直接转化入表达。F、通过与基因组DNA文库比较，可用于分析真核基因结构、组织和表达。2、cDNA文库的构建（1）、分离细胞总RNA，纯化出mRNA。tRNA、rRNA和mRNAmRNA占总RNA的1-5%，种类繁多，分子大小不一。显著特征：3`端有poly(A)。用Oligo(dT）结合在纤维素柱上，带poly(A)的mRNA可结合在柱上，而其它RNA则不能，从而使其与其它RNA分开。（2）、以mRNA分子为模板合成cDNA第一链：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，利用适当的引物合成的。引物：oligo(dT)引物：从3`端开始，适于较短的mRNA。随机引物：在mRNA的任何位置开始，适于较长的mRNA。（3）、双链cDNA的合成：A、自我引导合成：用碱处理使mRNA-DNA杂交分子中的mRNA降解，cDNA第一链解离，单链cDNA3`端自身环化，形成一个发夹环结构。在DNA聚合酶的作用下产生一个完整的发夹结构双链cDNA，S1核酸酶将发夹切去，即可。缺点：S1酶会多切，而丢失信息。AAAAAAAAAAD、PCR法：AAAAA（4）、将cDNA双链重组到质粒或噬菌体上导入大肠杆菌宿主细胞。A、标准方法将cDNA甲基化。防酶切B、末端转移酶加尾或加适当的衔接头与适当方法处理的载体连接。C、将重组DNA转化大肠杆菌宿主。常用的载体是λgt10/λgt101，一般不用转化效率低的质粒。AAAAAA45表达型cDNA文库的构建演示243、mRNA丰度与cDNA文库大小经验值是理论值的4.5倍左右四、利用PCR扩增目的基因1、套式PCR两对引物扩增同一样品的方法。从一个DNA模板的同一区域扩增出不同长度的片段而设计。2、反向PCR3、长程PCR4、反转录PCR五