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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CN104450675A(43)申请公布日(43)申请公布日2015.03.25(21)申请号201310452575.2(22)申请日2013.09.25(71)申请人中国林业科学研究院林业研究所地址100091北京市海淀区颐和园后中国林科院林业研究所(72)发明人张立峰韩素英齐力旺李水根张俊红(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书2页说明书12页序列表16页附图4页(54)发明名称一种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法(57)摘要本发明公开了一种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法。该方法包括如下步骤:1)根据基因组DNA上的已知序列设计三条方向一致用于扩增侧翼序列的特异性引物,按距离侧翼序列由远及近的顺序将其依次记为GSP1、GSP2和GSP3;2)以基因组DNA为模板,以引物SAP(序列1-15中任一)和所述GSP1进行第一轮PCR扩增,得到PCR产物1;3)以所述PCR产物1为模板,以引物SEP(序列16和17)和所述GSP2进行第二轮PCR扩增,得到PCR产物2;4)以所述PCR产物2为模板,以引物SNP(序列18)和所述GSP3进行第三轮PCR扩增,得到PCR产物3,从而获得所述侧翼序列。本发明所提供方法具有如下优点:操作简易、高特异性扩增、高成功率、容易得到大的片段、耗时短等。CN104450675ACN104450675A权利要求书1/2页1.一种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法,包括如下步骤:(1)选择基因组DNA上位于待扩增的侧翼序列旁侧的一个已知序列区,根据所述已知序列区的核苷酸序列设计三条方向一致用于扩增所述侧翼序列的特异性引物,将三条所述特异性引物按照距离所述侧翼序列由远及近的顺序,依次记为GSP1、GSP2和GSP3;(2)以所述基因组DNA为模板,以随机兼并引物SAP和所述GSP1进行第一轮PCR扩增,得到PCR产物1;所述随机兼并引物SAP为如下15种引物中的任一种:核苷酸序列如序列表中序列1所示的引物SAP1、核苷酸序列如序列表中序列2所示的引物SAP2、核苷酸序列如序列表中序列3所示的引物SAP3、核苷酸序列如序列表中序列4所示的引物SAP4、核苷酸序列如序列表中序列5所示的引物SAP5、核苷酸序列如序列表中序列6所示的引物SAP6、核苷酸序列如序列表中序列7所示的引物SAP7、核苷酸序列如序列表中序列8所示的引物SAP8、核苷酸序列如序列表中序列9所示的引物SAP9、核苷酸序列如序列表中序列10所示的引物SAP10、核苷酸序列如序列表中序列11所示的引物SAP11、核苷酸序列如序列表中序列12所示的引物SAP12、核苷酸序列如序列表中序列13所示的引物SAP13、核苷酸序列如序列表中序列14所示的引物SAP14、核苷酸序列如序列表中序列15所示的引物SAP15;(3)以所述PCR产物1为模板,以叠套引物SEP和所述GSP2进行第二轮PCR扩增,得到PCR产物2;所述叠套引物SEP由引物A和引物B组成,所述引物A的核苷酸序列为序列表中序列16,所述引物B的核苷酸序列为序列表中序列17;(4)以所述PCR产物2为模板,以引物SNP和所述GSP3进行第三轮PCR扩增,得到PCR产物3;从所述PCR产物3中获得所述侧翼序列;所述引物SNP的核苷酸序列为序列表中序列18。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述叠套引物SEP中,所述引物A和所述引物B的摩尔比为(1-2.5):10。3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:进行所述第一轮PCR扩增时,所述随机兼并引物SAP和所述GSP1的摩尔比为5:1;或/和进行所述第二轮PCR扩增时,所述叠套引物SEP中的所述引物A、所述引物B,以及所述GSP2三者的摩尔比为(1-2.5):10:10;或/和进行所述第三轮PCR扩增时,所述引物SNP和所述GSP3的摩尔比为1:1。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于:进行所述第一轮PCR扩增的反应条件为:94℃120s,1个循环;98℃10s,60℃30s,68℃2min,2个循环;98℃10s,25℃2min,0.2℃/s,68℃2min,1个循环;98℃10s,60℃30s,68℃2min,98℃10s,60℃30s,68℃2min,98℃10s,44℃30s,68℃2min,3-5个循环;68℃5min,1个循环;或/和进行所述第二轮PCR扩增的反应条件为:94℃120s;98℃10s,60℃30s,68℃2min,30个循环;68℃5min;或/和进行所述第三轮PCR扩增的反应条件为:94℃1