PCR法获取目的基因.ppt

PCR法获取目的基因PCR技术多聚酶链式反应(PolymeraseChainReaction)一、PCR技术的创建二、PCR技术的原理PCR原理
（1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存在

（3）重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。2.PCR技术的特点三、PCR的反应体系和基本步骤3.PCR反应条件
循环参数
（1）预变性：94℃5min
（2）变性：94℃20s-45s使双链DNA解链为单链
（3）退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间45s左右。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度
可增加反应的灵敏性。
（4）延伸：一般为72℃，时间由扩增片段长度决定。
（5）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次
次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入率增加。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。
（6）延伸补齐：72℃5min—10minPCR技术的注意事项四、PCR法获取目的基因由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时可以使用T载体克隆目的基因。
具有3‘-5’外切酶活性的DNA聚合酶（如pfu聚合酶），其扩增的PCR产物是平末端,要对这种平末端的PCR产物进行克隆,应首先对PCR产物的3‘末端进行加A的工作。工作程序如下2.设计酶切位点克隆PCR获取的目的基因1、不对称PCR
2、反向PCR(reversePCR)
3、多重PCR（复合PCR）
4、LP-PCR（Labelledprimers)
5、锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）
6、PCR固相分析法
7、原位PCR
8、反转录PCR（RT-PCR)
9、荧光定量PCR（real-timePCR)荧光定位PCR技术（FQ-PCR）PCR技术的应用举例：PCR技术的未来展望谢谢！
请老师和同学们批评指正。