PCR法获取目的基因培训课件.ppt

目录DNA，生命的蓝图PCR技术一、PCR技术的创建KaryB.Mullis（1944－）DNA聚合酶1983年Mullis的构思TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus，水生栖热菌)二、PCR技术的原理1PCR原理
（1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物

（2）PCR过程：由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成
①变性：94℃左右，使双链DNA模板解离成为单链；
②复性：55℃左右，引物与模板DNA单链互补配对结合；
③延伸：72℃左右，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的DNA链

（3）重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。加热3PCR技术的特点三、PCR的反应体系和条件PCR技术的基本过程(1)PCR技术的基本过程(2)PCR技术的基本过程(3)注意事项1）PCR反应成分（2）引物（Primer）
浓度：0.1-0.5mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。
PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计可遵循下列原则：
①引物长度：约16-30bp，太短会影响引物与模板的配对；
②四种碱基随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，这样易导致错误引发（falsepriming）；
③引物中G+C含量：通常为40-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度——Tm＝4(G+C)+2(A+T)；
④引物3’端：关键碱基，必须与模板完全配对，最好对应密码子的第一或第二位核苷酸，以减少由于密码子摆动产生的不配对；⑤引物内部：尤其在3’端，不存在二级结构（Hairpin）、二聚体（Dimer）；
⑥两引物之间：尤其在3’端，不能互补以防出现引物二聚体（crossdimer），减少产量；两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性；
⑦引物5’端：对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5’端限制酶位点外再加3-4个保护碱基；
⑧引物不产生falsepriming：不与模板结合位点以外的序列互补，避免错误引发PCR扩增。（3）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)
①浓度：0.5-2.5U/50L体系，所用的酶量可根据DNA、引物及
其它因素的变化进行适当的增减，酶量增加使反应特异
性下降，酶量过少影响反应产量；
②TaqDNA聚合酶活性的半衰期：92.5℃130min；95℃40
min；97℃5min；
③TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义：74℃下，30min，掺入
10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量；
④TaqDNA聚合酶的出错率：一般PCR中出错率为1×10-5/
每碱基对，在利用PCR克隆和进行序列分析时应注意。
⑤类型：TaqDNA聚合酶:普通型，PCR产物末端为A；
PfuDNA聚合酶(Pyrococcusfuriosus):高保真，出错率
为1×10-6/每碱基对PCR产物为平末端。（4）反应缓冲液（PCRbuffer）
组分：一般含10-50mmol/LTris•Cl(20℃下pH8.3-8.8)、50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+；
Tris•Cl：在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8；
50mmol/L的KCl：有利于引物的退火；
Buffer中加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)，可稳定酶活性；
加入T4噬菌体的基因32蛋白对扩增较长的DNA片段有利；
各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。（5）Mg2+（6）dNTP（4种三磷酸脱氧核苷酸）
浓度：20-200μmol/L，dNTP浓度取决于扩增片段的长度，浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量；理论上4种dNTP各20μmol/L,就足以在100μL反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性；
四种dNTP浓度应相等，以减少合成中由于某种dNTP不足而导致的掺入错误；
dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。
dNTP制备：应用NaOH将dNTP溶液的pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装，-20℃贮存。3/6/20252）循环参数
（1）预变性：94℃5min
（2）变