激光扫描共聚焦显微GHX.ppt

采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上，使用紫外或可见光激发荧光探针，采用共轭聚焦原理和装置，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套集观察、分析和输出为一体系统。它把光学成像的分辨率提高了30%~40%，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。HippocampusneuronsexpressingGFP第四页，共六十五页。LSCM与普通荧光显微镜的图像质量比较LSCM的重要组件第十三页，共六十五页。激光扫描共聚焦显微镜vs荧光显微镜激光作为光源的优点
单色性强谱线宽度可小于10-8nm
方向性强发射角仅为毫弧度数量级
高亮度
相干性好
基于上述主要特点，激光作为扫描共聚焦显微镜的光源是最理想的显微镜物镜LSCM物镜的重要参数NA数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。是物镜的主要技术参数，是判断物镜性能高低的重要标志。
N.A=n*sina/2
n：物体与物镜间媒质的折射率
a\2：物镜孔径角的一半
溴萘折射率1.66，香柏油1.515，玻璃1.52，水的为1.3，空气为1。香柏油与玻璃折射率相似，故光折射少，透光率高，成像清楚。

N.A.越大：放大倍数越大，分辨率越高，
N.A.越大：视场宽度与工作距离越小载物台计算机系统图像分析与控制系统第二十六页，共六十五页。第二十七页，共六十五页。激光共聚焦显微镜原理图1.共聚焦显微镜简化原理图
用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(lightsourcepinhole)被二向色镜(Dichroicmirror)反射，通过显微物镜(Objectivelens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focalpoint)处。激光照射所产生的荧光(fluorescencelight)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detectionpinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD）），变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。
图2.探测针孔的作用示意图（解释了出射小孔所起到的作用）
只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focalpoint)是一一对应的关系（共轭conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术。LSCM扫描图像方式单一光学切片扫描(singleopticalsection,x-y)时程活细胞扫描(timelapselivecellimaging,x-y-t)三维扫描及重构(3-Dreconstruction,x-y-z)三维扫描及重构(3-Dreconstruction,x-y-z)一种高分辨率的显微成像技术4用计算机采集和处理光信号，并利用光电倍增管放大信号，它代替了人眼和照相机进行观察，摄像，得到的图像是数字化的，可以在电脑中进行处理，进一步提高图像的清晰度。
5观察活细胞、活组织：ＬＳＣＭ在不损伤细胞的前提下,对活组织、活细胞进行观察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观察过的样品还可以继续用于其他的研究。这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。6生化成分精确定位观察配合专用的分子探针,对于要检测的成分不仅可以定位到细胞水平,还可以定位到亚细胞水平和分子水平。
7动态观察在同一样品平面上随时间进行连续扫描,就可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化。目前在这方面做得最多的是使用ＬＳＣＭ观察心肌或平滑肌细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或ｐＨ的动态变化。
8定量测量：首先应用专一的荧光探针对样品进行染色,样品的荧光强度和所测成分的含量呈正比,如果其余条件固定,通过对比各组样品之间的荧光强度值,可得出特定成分的含量比。应用范围
细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动
性、受体、细胞器结构和分布变化
生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析
药理学：药物对细胞的作用及其动力学
生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布
动态神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞分布
微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构
病理学及临床应用：活检标本诊断、肿瘤