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突破衍射的束缚
——激光扫描共聚焦显微镜

激光扫描共聚焦显微镜
探索微观世界的神奇奥秘，必须要使用一些非常先进的“利器”。例如原子力显微镜，扫描隧道显微镜等。激光扫描共聚焦显微镜也是显微镜中的一种。它，诞生于20世纪80年代。它的出现是显微镜发展史上的一次巨大跨越，是一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。它可以使图像更为清晰，与计算机及相应软件技术结合，可以时时监控。与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，并可形成清晰的三维图像等优点。所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。希望通过本专题，能够让大家了解微观世界，亲身鉴赏到显微技术发展所带来的视觉震撼。
共聚焦显微镜原理

知识窗——
光的衍射

光在传播过程中，遇到障碍物或小孔（窄缝）时，它有离开直线路径绕道障碍物阴影里去的现象。这种现象叫光的衍射。衍射时产生的明暗条纹或光环，叫衍射图样。
由于光的波长很短，只有十分之几微米，通常物体都比它大得多，但是当光射向一个针孔、一条狭缝、一根细丝时，可以清楚地看到光的衍射。用单色光照射时效果好一些，如果用复色光，则看到的衍射图案是彩色。
激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图像分析仪器，现已广泛应用于荧光定量测量、共焦图像分析、三维图像重建等方面。其性能为普遍光学显微镜质的飞跃，是电子显微镜的一个补充。
传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。

传统显微镜和激光扫描共聚焦显微镜所拍摄图片（）

共聚焦原理图（）
激光共聚焦显微镜作为光学显微镜的重大改进，与传统照明显微镜相比有许多独特的优势:它可以控制焦深、照明强度、降低了非焦平面上光线噪音干扰，观察到非常清晰的高质量图像。事实上，共聚焦技术已经成为光学显微镜的一个最重要的技术突破。通过对比传统显微镜和激光扫描共聚焦显微镜所拍摄的图片不难看出，采用相同切片的前提下，共聚焦显微镜拍摄的图片（b）、（d）、(f)更加清晰细腻、层次分明，不仅利于学术研究，也具备了一定的艺术鉴赏价值。

激光扫描共聚焦显微镜的应用

细胞的三维重建

细胞的三维立体图（）
普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描。可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。

长时程观察细胞迁移和生长

共聚焦激光显微镜分析细胞凋亡过程（）
目前激光扫描共聚焦显微镜的软件一般均可自动控制地进行定时的激光扫描，而且由于新一代激光扫描共聚焦显微镜的探测效率的提高，只需要很小的激光能量就可以达到较好的图像质量，从而减小了每次扫描时激光对细胞的损伤，因此，可以用于数小时的长时程定时扫描，记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。
拓展思考

1.激光共聚焦显微镜的工作原理是什么？
2.什么是光的衍射？
3.激光共聚焦显微镜和普通的电子显微镜有什么不同？
4.激光共聚焦显微镜的优点是什么？