共聚焦激光扫描显微镜.ppt

共聚焦激光扫描荧光显微镜什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？

共聚焦激光扫描荧光显微镜（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM）
以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统荧光和荧光显微镜二、荧光显微镜术的基本原理荧光显微镜的不足:

1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重荧光的同时采集及共定位。
2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。
3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。
4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。
5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度—荧光强度不够。
6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠
7.只能在二维环境下观察。
8.样品不能太厚。
9.荧光的串绕无法回避。
10.放大倍率小。共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置光电倍增管LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成象质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。扫描装置
台扫描系统和镜扫描系统。
台扫描通过步进马达驱动载物台，位移精度可达0.lμm，能够有效地消除成象点横向象差，使样品信号强度不受探测位置的影响，可准确定位定量地扫描检测视野中每一物点的光强度，缺点是载物台机械移动、图象采集速度较慢。
镜扫描有双镜扫描和单镜扫描两种，通转镜完成对样品的扫描。由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度大大提高，512×512画面每秒可达4帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定，但因光路略有偏转会对通光效率和象差有所影响。扫描系统的工作程序由计算机自动控制。激光光源
LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。
单个激光优点是安装方便，光路简单，但价格较贵并存在不同激光之间的光谱竞争和色差校正问题。
多激光器系统优点是各谱线激光单独发射，不存在谱线竞争的干扰，调节方便，但光路复杂，光学系统共轴垂直调试要求高。
多激光器系统在可见光范围使用多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红激光器发射波长为633nm的红光，新的405nm半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线。检测系统
LSCM为多通道荧光采集系统，光路上要求至少有三个荧光通道和一个透射光通道，可对物体进行多谱线激光激发.
样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT，配有高速12位A/D转换器，可以做光子计数。
每个PMT前设置单独的针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要。
共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域1细胞的三维重建
1细胞的三维重建
LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析，染色体分析，细胞程序化死亡的观察，细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。
三维胶原基质培养的血管平滑肌细胞三维胶原基质培养的血管平滑肌细胞2细胞定量荧光测定
LSCM对细胞分层扫描，单独测定，经积分后能得到细胞荧光的准确定量，重复性极佳。
它适于活细胞的定量分析，可测定细胞内溶酶体、线粒体、DNA含量、RNA含量、酶和结构性蛋白质等物质含量和分布，常用于原位分子杂交，肿瘤细胞识别，单个活细胞水平的DNA损伤及修复的定量分析。2细胞定量荧光测定
适于快速高灵敏度测量，减少光粹灭的影响，在定量免疫荧光测定方面应用广泛，如作各种肿瘤组织切片抗原表达的定量分析，监测肿瘤相关抗原表达的定位定量信息，监测药物对肌体免疫功能的作用，监测自身免疫性疾病的多种抗原及药物对肌体免疫功能的作用，监测细胞结合和杀伤的形态特征并作定量分析等。细胞定量荧光测定可选用单荧光,双荧光和三荧光方式，能自动测定细胞面积，平均荧光强度，积分荧光强度及形状因子等多种参数。3细胞内钙离子PH值和其它离子的动态分析
通过Indo－1、Fluo－2、Fluo－3、Calciumgreen、SNARF等多种荧光探针，可对细胞内钙离子等作荧光标记并对它们进行比率值和浓度梯度变化测定。由于细胞内钙离子为传递信息的第二信使，对细胞生长分化起着重要作用，通过单标记或双标记对细胞内钙离子和其它离子的荧光强度和分布精确测定，测定样品达到毫秒级的快速变化。3细胞内钙离子PH值和其它离子的动态分析
借助光学切片功能可以测量样品深层的荧光分布以及细胞光学切片的生物化学特性的变化。通过不同时间段的检测可测定细胞内离子的扩散速率，了解它对肿瘤启动因子、生长因子等刺激的反应。细胞内离子测量广泛用于肿瘤研究、组织胚胎学、细胞生物