第二章基因工程工具酶限制酶ppt课件.ppt

第二章

基因克隆所需的工具酶一、限制性内切酶(restrictionenzyme)
1．限制性核酸内切酶的发现
限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出了2300种以上，可识别230种不同的DNA序列。
早在本世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄生控制的限制(restriction)和修饰(modification)系统。
在限制修饰系统中限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；

而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制修饰系统中修饰作用的含义。
2．核酸内切限制酶的类型

（2）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，例如Ecok。

（3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示。因此，流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、HindIII等等。
（4）所有的限制酶，除了总的名称核酸内切限制酶R外，还带有系统的名称，例如核酸内切酶R．HindIII。同样地，修饰酶则在它的系统名称之前加上甲基化酶M的名称。相应于核酸内切酶R．HindIII的流感嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M.HindIII。

在实际应用上，这个命名体系已经作了进一步的简化：
①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以现在通行的是把全部略语字母写成一行。
②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶的地方，核酸内切酶的名称R便被省去。
4.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
a.识别位点：

绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。b.切割类型：

检验了非常大量的实验事例之后发现，由核酸内切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是属于下述两种独特的排列方式之一：

（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段；

（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。
c.产生的末端特征：

我们所说的粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。

平末端的DNA片段则不易于重新环化。
(2)同裂酶(isoschizomers)

有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶(isoschizomers)。

同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。例如，限制酶HpaⅡ和MspI是一对同裂酶，共同的靶子序列是CCGG。
与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。
常用的BamHI,BclI,BglI,XhoI就是一组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由-GATC-4个核苷酸组成的粘性末端，很显然，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”(hybridsite)。但必须指出，这类杂种位点的结构，一般是不再被原来的任何一种同尾酶所识别的。例如：
SalI（5`-GTCGAC-3`）和
XhoI(5`-CTCGAG-3`)的消化片段相连，但所形成的重组片段（5`-GTCGAG-3`）则不能被上述2种酶的任一种酶识别和切割。但也有例外。
5．影响核酸内切限制酶活性的因素

(1)DNA的纯度

核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效率，在很大程度上是取决于所使用的DNA本身的纯度。污染在DNA制剂中的某些物质，例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸钠)、以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。
为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法：
①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。
②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。
③延长酶催化反应的保温时间。
(2)DNA的甲基化程度

核