【精选】基因工程工具酶限制酶.ppt

第二章基因克隆所需的工具酶一、限制性内切酶(restrictionenzyme)1．限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》的统计数字仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中分离出了2300种以上可识别230种不同的DNA序列。早在本世纪中期以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础发现了原核生物体内存在着寄生控制的限制(restriction)和修饰(modification)系统。在限制修饰系统中限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰可免遭自身限制性酶的破坏这就是限制修饰系统中修饰作用的含义。2．核酸内切限制酶的类型切割位点3．核酸内切限制酶的命名法由于发现了大量的限制酶所以需要有一个统一的命名法。H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统已被广大学者所接受。他们建议的命名原则包括如下几点：（1）用属名的头一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如大肠杆菌(Escherichiacoli)用Eco表示流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)用Hin表示。（2）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型例如Ecok。（3）如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制与修饰体系则以罗马数字表示。因此流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、HindIII等等。（4）所有的限制酶除了总的名称核酸内切限制酶R外还带有系统的名称例如核酸内切酶R．HindIII。同样地修饰酶则在它的系统名称之前加上甲基化酶M的名称。相应于核酸内切酶R．HindIII的流感嗜血菌Rd菌株的修饰酶命名为甲基化酶M.HindIII。在实际应用上这个命名体系已经作了进一步的简化：①由于附有标注字母在印刷上很不方便所以现在通行的是把全部略语字母写成一行。②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶的地方核酸内切酶的名称R便被省去。4.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性a.识别位点：绝大多数的II型核酸内切限制酶都能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。b.切割类型：检验了非常大量的实验事例之后发现由核酸内切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型通常是属于下述两种独特的排列方式之一：（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段；（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。c.产生的末端特征：我们所说的粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平末端的DNA片段则不易于重新环化。(2)同裂酶(isoschizomers)有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列这类酶特称为同裂酶(isoschizomers)。同裂酶产生同样的切割形成同样的末端。例如限制酶HpaⅡ和MspI是一对同裂酶共同的靶子序列是CCGG。与同裂酶对应的一类限制性内切酶它们虽然来源不同识别的靶序列也各不相同但都能产生相同的粘性末端特称为同尾酶。常用的BamHIBclIBglIXhoI就是一组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由-GATC-4个核苷酸组成的粘性末端很显然由同尾酶所产生的DNA片段是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的因此在基因克隆实验中很有用处。由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点特称之为“杂种位点”(hybridsite)。但必须指出这类杂种位点的结构一般是不再被原来的任何一种同尾酶所识别的。例如：SalI（5`-G