基因工程的工具酶PPT课件.ppt

基因工程的工具酶核酸酶的分类：
1）根据核酸底物分RNA酶（Rnase）、DNA酶（Dnase）和底物非专一性核酸酶；
2）根据作用方式分内切核酸酶（endonuclease）和外切核酸酶（exonuclease）；
3)根据对底物碱基专一性分碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）和非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性）
在限制修饰系统中，限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；
而生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可免遭自身限制性内切酶的破坏。
限制－修饰作用实际就是细菌中的限制性内切酶降解外源DNA，维护自身遗传稳定的保护机制。
用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的切割类型：
（1）两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段；
（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。

EcoRⅠ等产生的5’粘性末端PstⅠ等产生的3’粘性末端PvuⅡ等产生的平头末端3.病毒性肺炎如冠状病毒、腺病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等。
4.真菌性肺炎如白念珠菌、曲霉、放射菌等。
5.其它病原体所致的肺炎如立克次体、弓形虫、原虫、寄生虫如肺包虫、肺吸虫、肺血吸虫）等。机体免疫力低下者（如艾滋病患者）容易伴发肺部卡氏肺包子虫、军团菌、鸟形分支杆菌、结核菌、弓形体等感染。
6.理化因素所致的肺炎如放射性肺炎、胃酸吸入、药物等引起的化学性肺炎等。
7.支原体肺炎由肺炎支气体引起。
编辑本段发病原因

肺炎

患肺炎的原因可能是：接触到一些厉害的病菌或病毒身体抵抗力弱，如长期吸烟。上呼吸道感染时，没有正确处理。例如是没有正确地看医生、没有正确地看服药，又或者是滥用止咳药止咳以至痰和菌愈积愈多（Sputumretention)。
如果一年内有多过一次真正的肺炎（一些医生误看X光片或滥用了肺炎的诊断)，原因可能是：身体抵抗力弱（先天性或后天性)气管有异物。尤其是幼童。心肺有其它病变：如癌病、气管扩张、肺尘埃沉着病、没有正确地看医生、没有正确地看服药，又或者是滥用止咳药止咳以至痰和菌愈积愈多（Sputumretention)工作环境有问题。注意改善空气流通、冷气系统。位点偏爱（sitepreference）
某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。

星号活性（staractivity）
又称星活性，一些限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，如酶浓度过高、反应液离子强度过低、pH改变、有机溶剂的影响等条件，酶切割位点专一性发生改变。
同裂酶(isoschizomers)有些来源不同的限制性核酸内切酶识别同样的核苷酸靶序列，产生同样的切割，形成同样的末端。

例如，XmaI（CCCGGG）
SmaI（CCCGGG）
限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素限制性核酸内切酶酶活性的正常发挥，是绝对需要二价阳离子，通常是Mg2+。
缓冲液Tris—HCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值范围之内。对绝大多数限制酶来说，在pH=7.5的条件下，其功能最佳。
巯基试剂对于保持某些内切酶的稳定性是有用的，但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。
影响限制性核酸内切酶活性的因素
酶切消化反应的温度

大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃，但也有许多例外的情况。
限制性内切酶反应的终止

消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法是65℃温浴5分钟。但有些酶，如BamHI和HaeⅡ具备对热稳定性，则需加入终止反应液（加入0.5mol／L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10mmol/L以螯合Mg2+）。
限制性核酸内切酶的特点限制性核酸内切酶的应用利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤：
不同的限制酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此，所以建议遵循与酶一起提供的说明书进行操作。
以下是对0.2—1.0ugDNA进行消化的典型反应步骤，如要对更大量的DNA进行消化，则反应的各个成分须相应放大。1)加入合适体积的DNA溶液；
2)加入2ul适当的10X限制酶消化缓冲液，轻敲管外壁以混匀之；
3)加入1－2单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之；
4)将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育；
5)加入0.5M/LEDT