基因工程中工具酶限制酶的应用培训课件.ppt

基因工程中工具酶限制酶的应用基因工程工具酶基因工程工具酶徐师大-屈艾老师制作第一节限制性核酸内切酶和DNA片段化（九个问题）一、限制性内切酶(restrictionenzyme)的发现1．限制性核酸内切酶：---是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出2300种以上，可识别230种不同的DNA序列。2、发现早在20世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株的平板培养效应的研究中，就发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制(Restriction)和修饰(Modification)系统（R-M系统）。在限制--修饰系统中限制作用是指宿主细菌可以通过自身限制酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制，而保护了宿主菌；而生物细胞(如宿主)的DNA分子合成后，通过自身修饰酶的作用，使特定位置上的碱基发生甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是R--M系统中修饰作用的含义。1978年W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖。l徐师大-屈艾老师制作二．核酸内切限制酶的类型及切割频率1、类型切割位点距离识别位点的情况2、切割频率酶的识别序列是6bp时，则其切割频率为(1/4)6=1/4096，即每隔4.1kb就可能有一个切割点。当识别序列为n个bp，则其切割频率为（1/4）n。三．核酸内切限制酶的命名原则由于发现了大量的限制酶，所以需要有一个统一的命名法。H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统，已被广大学者所接受。他们建议的命名原则包括如下几点：（1）用属名的第1个字母（大写）和种名的头2个字母（小写），组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如，大肠杆菌(Escherichiacoli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)用Hin表示。限制性核酸内切酶的命名（2）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，例如Ecok、Hind。（3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的R-M体系时，则以罗马数字表示。例如，流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、HindIII等等。（4）名称：限制酶，核酸内切限制酶用R表示外，还要带有系统的名称，例如，流感嗜血菌核酸内切酶R．HindIII；修饰酶，则在它的系统名称之前加上甲基化酶M表示。相应于核酸内切酶R．HindIII的流感嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M.HindIII。但在实际应用上，这个命名体系已经作了进一步的简化：①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以现在通行的是把全部略语字母写成一行。②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶的地方，限制性核酸内切酶的名称R便被省去。四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性A.识别序列EcoRⅠ：B.切割类型：检验大量的实验事例之后发现，由核酸内切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是属于下述两种排列方式之一：（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段（3’-和5’-）；（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平齐末端的DNA片段。三种酶切末端产生的末端特征：我们所说的粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构（若是-3），它们能够通过互补碱基间的配对而重新连结起来。平末端的DNA片段与粘性末端相比，则不易于重新连结，耗能多。(2)同裂酶(isoschizomers)来源不同的限制酶识别序列相同，产生同样的切割，形成同样的末端，这类酶称为同裂酶(isoschizomers)。若同裂酶的切点相同，会形成同样的末端。例如，HpaⅡ和MspI（C/CGG）；来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,称为同尾酶。常用的BamHI,BclI,BglⅡ,XhoI就是一组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由-GATC-4个核苷酸组成的粘性末端，很显然，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆中很有用处。例如：由同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，称之为“杂种位点”(hybridsite)。但必须指出，这类杂种位点的结构，一般不能再被原来的任何一种同尾酶所识别切割的。例如：SalI（5`-GTCGAC-3`）和XhoI(