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靶向大鼠OPN基因的siRNA表达载体的构建与鉴定
论文：靶向大鼠OPN基因的siRNA表达载体的构建与鉴定
摘要
骨基质蛋白（OPN）作为一种重要的细胞外基质蛋白，参与了许多生理和病理过程。在炎症、肿瘤、心血管疾病等疾病中，OPN的过度表达与疾病发生及其发展密切相关。因此，靶向OPN基因的RNA干扰技术成为调控其表达的有效手段。在本研究中，我们成功构建了一种靶向大鼠OPN基因的siRNA表达载体，并进一步对其鉴定验证。
关键词：骨基质蛋白；RNA干扰；表达载体构建；鉴定
引言
骨基质蛋白（OPN）是一种含有多种功能肽链结构的磷酸酯化糖蛋白，广泛存在于生物体中的各类组织和器官中。它参与了许多生理和病理过程，如骨骼形成、免疫调节、炎症反应、肿瘤侵袭和转移等。近年来，研究表明OPN的过度表达与许多疾病的发生及其发展密切相关，例如炎症、肿瘤、心血管疾病等，因此调控OPN的表达成为许多研究的重点。
RNA干扰技术是一种常用且有效的调控基因表达的方法，其中小干扰RNA（siRNA）技术已被广泛应用于基因沉默和抑制。在本研究中，我们设计合成了靶向大鼠OPN基因的siRNA序列，并构建了一种siRNA表达载体，以实现靶向OPN基因的RNA干扰。同时，我们对该载体的表达及其对细胞OPN表达的影响进行了鉴定。
材料与方法
1.构建siRNA表达载体
在设计siRNA靶向大鼠OPN基因时，采用RNAi设计工具的帮助，以OPNmRNA序列为模板，设计了3个潜在的siRNA序列，并进行了预实验验证。最终选取的siRNA序列为：sense序列GGAAUUCCCATCAAAGUAAtt，antisense序列UUAUCUUUGGGAUUCCUCAtt。该siRNA序列在含有H1转录子的质粒pGreenPuro中，构建了靶向OPN基因的siRNA表达载体pGreenPuro-OPNsiRNA。
2.细胞培养、转染、西方半定量分析
将表达大鼠OPN的BRL细胞进行培养，按照Lipofectamine2000试剂盒的操作指南，将pGreenPuro-OPNsiRNA载体转染至BRL细胞中，并设置无载体的细胞对照组和空载体转染的阴性对照组。转染后，采用Westernblotting分析细胞中OPN蛋白表达及其干扰程度，SDS-PAGE分离蛋白质样品，用Tris-glycinebuffer转移至PVDF薄膜上，然后进行一般的免疫印迹。最后利用荧光素检测显像仪检测信号强度并定量分析。
结果与讨论
我们成功地构建和鉴定了靶向大鼠OPN基因的siRNA表达载体。在Westernblotting实验中，我们发现在转染了pGreenPuro-OPNsiRNA载体的BRL细胞中，OPN蛋白表达量显著下降，且与负载体和空载体转染细胞相比，差异明显。这表明pGreenPuro-OPNsiRNA载体可以成功抑制BRL细胞中OPN基因的表达，达到RNA干扰的效果。
总结
在本研究中，我们成功构建了靶向大鼠OPN基因的siRNA表达载体，并验证了该载体对OPN基因表达的干扰效果。这为深入研究OPN的生物学功能及其在疾病中的作用提供了一个有效的工具和手段。
参考文献
1.Denhardt,D.T.,Chambers,A.F.(2003).Overcomingobstaclestometastasis--defensesagainsthostdefenses:osteopontin(OPN)asarenegadeexampleoftheextracellularmatrix.
2.Singh,R.,andMishra,M.K.(2017).Osteopontin:adjunctivetherapyforcancer.FrontBiosci(EliteEd),9,398-409.
3.Wu,Y.J.,etal.(2016).Osteopontinasabiomarkerforcancer:asystematicreview.JCancerResClinOncol,142,789-802.