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多药耐药基因－腺病毒重组表达载体的构建及鉴定

【摘要】目的构建多药耐药（multidrugresistance，MDR）基因-腺病毒重
组表达载体。方法将MDR1基因插入到腺病毒载体，用磷酸钙沉淀法将此重组
载体转染到293细胞，制备重组病毒悬液并感染靶细胞进行鉴定。结果构建的
MDR1-腺病毒载体在293细胞中大量产生，病毒滴度达109PFU/ml，此病毒感
染靶细胞后，在靶细胞中有MDR1基因的表达。结论成功构建了MDR1-腺病
毒重组表达载体。

【Abstract】ObjectiveConstructionofmulti-drugresistancegene(MDR)-
adenoviralrecombinantexpressionvector．MethodsMDR1genewillbeinsertedinto
theadenovirusvector，bycalciumphosphateprecipitationmethodtherecombinant
plasmidtransfectinto293cells．Recombinantvirussuspensionismadeandinfeced
targetcellsandtoindentify．ResultsConstructedMDR1-adenovirusvectorproduces
alargenumberin293cells，thevirustiterisupto109PFU/ml．Aftertherecombinant
virusinfectedtargetcellsinthetargetcellshavetheexpressionofMDR1
gene．ConclusionMDR1-recombinantadenorirusvectorhasbeensuccessfully
constructcd．

【Keywords】Multi-drugresistancegene(MDR1)；Adenovirusvector；
Transfection

多药耐药性（multidrugresistance，MDR）是指肿瘤细胞能对多种结构、
功能及杀伤机制均不同的化疗药物产生耐受。肿瘤组织多药耐药性的产生主要是
由于肿瘤细胞内多药耐药基因（MDR1）异常扩增和过渡表达所致，表达产物
为分子量170kd的糖蛋白（P-glycoprotein，P-GP）。该蛋白作为一种依赖
ATP能量的大分子药物或毒物的溢出泵，可把进入细胞内的药物或异物排出细
胞外，使肿瘤细胞产生耐药。利用MDR1的这一特性，本研究使用腺病毒作为
载体，构建MDR1基因-腺病毒重组表达载体，并转导入脐血有核细胞，对此
重组载体转染靶细胞的有效性进行鉴定。

1材料与方法

1．1材料PHAMDR质粒,美国国立健康研究院GreegarD．Odegaarden博
士惠赠；腺病毒载体试剂盒,DNA修平试剂盒，粘粒载体，TaKaRa公司；
RPMI1640,GIBCO公司；FCS，TBD公司；DNA纯化/回收试剂盒，北京鼎国；
MDR1包装试剂盒，Novagen公司。HEK293细胞，感受态大肠杆菌DH5α，由
吉林省肿瘤防治研究所保存。

1．2MDR1的体外扩增将PHAMDR质粒转化到感受态大肠杆菌DH5α[1]，
并将此感受态细菌接种到含氨苄(50μg/ml)的LB培养基中筛选阳性克隆进行扩
增，用碱裂解法提取PHAMDR质粒DNA[2]。

1．3扩增的PHAMDR质粒的鉴定及回收

1．3．1PHAMDR质粒的鉴定将提取的质粒DNA沉淀溶解后用XholI和
SacII进行双酶切，然后将质粒DNA及过夜双酶切的质粒DNA同时用0．8%
的琼脂糖进行电泳，鉴定MDR1基因扩增效果，结果见图1、2。

1．3．2MDR的回收将电泳所见4．5kb附近的泳带切回,按DNA回收试
剂盒说明进行回收，将回收的DNA贮存于-20℃冰箱。

1．4MDR1-腺病毒重组表达载体的构建将回收的MDR1基因用DNA修平
试剂盒修平后（DNA-TPC），与粘粒载体(CosmidDNA)进行连接，用磷酸钙共
沉淀法将CosmidDNA和DNA-TPC转染到293细胞，2周左右在一些培养孔内
可以观察到细胞的病变和死亡，转移这些已经完全死亡培养孔的培养液（含死细
胞）到一个消毒的1．5ml的离心管中，反复冻融6次后，5000r/min离心5min，
收集上清，即为重组病毒悬液。储存在-80℃，备用。

1．5MDR1-腺病毒重组表达载体的鉴定采用MDR1-腺病毒重组表达载体
感染靶细胞（脐血有核细胞）的方法。

1．5．1脐血有核细胞的获取用氯化胺裂解法[3]分离脐血有核细胞，调细
胞浓度为5×107/ml，加入到2