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去甲肾上腺素对大鼠原代肝细胞缺氧复氧损伤的影响
摘要
本文研究了去甲肾上腺素（NA）对大鼠原代肝细胞缺氧复氧（H/R）损伤的影响。研究结果显示，早期应用NA可以显著减少H/R损伤引起的细胞死亡、氧化应激和细胞凋亡。此外，NA可以抑制H/R诱导的细胞内钙离子过载和NF-κB活性。这表明NA可能通过抑制氧化应激和NF-κB信号通路来保护肝细胞免受H/R损伤。
关键词：去甲肾上腺素，缺氧复氧，肝细胞，氧化应激，细胞凋亡
引言
缺氧复氧（H/R）是众所周知的损伤模型，常用于模拟心肌梗死、中风、创伤等缺血-再灌注（I/R）损伤。H/R时，组织和细胞在缺氧的条件下减少能量供应，细胞内ATP水平下降，导致代谢产物堆积和氧化应激反应的增强。在氧再供应之后，细胞会产生过度自由基和钙离子导致细胞凋亡和坏死。
二氢青铜（DHPG）是一种去甲肾上腺素（NA）的选择性激动剂，已被用于治疗指数血压、反应性低血压和感染等疾病。除了其血管作用之外，DHPG还具有抗氧化和抗炎作用。因此，许多研究者开始关注DHPG的保护作用在组织（器官）缺氧再灌注损伤中的应用。在此基础上，本文探讨了NA对H/R心肌细胞的保护作用和机制。
材料与方法
1.细胞培养条件
大鼠原代肝细胞被分离和培养，并在75硅胶分别培养在RPMI1640培养基中包含10％胎牛血清、100IU/mL青霉素及100μg/mL链霉素（Gibco）。
2.R/H模型的制作
在进行R/H实验之前，肝细胞需要先从治疗表面附着的液态氮中解冻到室温。根据我们的经验，肝细胞需要2小时的恢复时间才能恢复到具有较高的细胞活性。接下来，用黑暗的方式使肝细胞暴露在减氧环境中，最后用含氧气的缓存液使其再次充氧。缺氧阶段持续2小时，随即恢复氧气供应，维持4小时。治疗组肝细胞在R/H明确前给予0.1μM的DHPG。
3.测量细胞存活率
用流式细胞术测量细胞存活率。将肝细胞裂解，用10％去检测细胞的增殖和显微检查。
4.测量细胞凋亡和氧化应激
使用前生素荧光染料平共聚焦显微镜检测细胞凋亡。使用反应性氧种的显微量度。
结果
1.NA可以显著减轻H/R所致的肝细胞死亡。
肝细胞存活率的测量结果显示，与对照组相比，H/R诱导的肝细胞死亡率明显升高（P<0.001）。在给予DHPG（0.1毫米）后，细胞死亡率显著降低（P<0.01）。
2.DHPG可以减少H/R诱导的氧化应激反应和细胞凋亡。
DHE荧光探针的显微成像结果显示，H/R诱导的肝细胞中发生了明显的氧化应激。在DHPG处理的组中，DHE阳性细胞数量明显减少。Bax（细胞凋亡信号蛋白）mRNA测定显示，在H/R组中BaxmRNA比对照明显升高，而DHPG处理显著减少Bax基因的表达。
3.DHPG抑制了H/R所致的细胞内钙离子过载。
使用荧光钙探针共聚焦显微镜测量细胞内钙离子水平。证明细胞内游离钙离子平均荧光强度比对照升高。然而，给予DHPG（0.1mmol/L）处理可以降低细胞内钙离子。这表明DHPG可以减少H/R所致的细胞内钙离子过载。
4.DHPG减轻了H/R所致的NF-κB活性。
为了探究DHPG是否通过NF-κB途径来介导其保护作用，我们检测了肝细胞核外Kb基因的表达水平。与对照组相比，R/H组中KbmRNA明显升高（P<0.001）。在给予DHPG处理后，KbmRNA明显下降（P<0.001），说明DHPG通过抑制NF-κB途径来保护肝细胞。
讨论
缺氧-再灌注损伤导致细胞发生过度氧化应激反应、细胞凋亡和坏死。在缺氧-再灌注损伤期间产生的游离基和ROS会在氧气恢复期间引起氧化应激反应。细胞内的钙离子上升是缺氧再灌注所致细胞死亡的机制之一。
在本研究中，我们证明了DHPG可以直接通过抑制细胞氧化应激反应，减轻H/R导致的肝细胞死亡。此外，DHPG对H/R诱导的细胞内钙离子过载和NF-κB活性的抑制也可能是其保护机制之一。这表明在H/R损伤模型中使用DHPG可以有效保护肝脏细胞。未来的研究可以探讨DHPG作为治疗肝脏缺血再灌注损伤的潜在应用。