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海蚕抗菌肽Perinerin在毕赤酵母中的表达及活性测定
摘要：
海蚕抗菌肽Perinerin是一种具有广谱抗菌活性的肽类分子。本研究在毕赤酵母中进行了Perinerin的表达和活性测定。首先，通过PCR扩增得到Perinerin基因序列，并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上。然后，将构建好的表达质粒转化到毕赤酵母GS115中，利用重要酵母菌体株GS115实现Perinerin的高效表达。采用Ni2+-NTA纯化方法纯化得到高纯度的Perinerin，并利用蛋白质电泳和Westernblot证明其纯化和表达效果。最后，采用文斯汀染色法和琼脂糖扩散法对Perinerin的抗菌活性进行测定，结果表明Perinerin在毕赤酵母中具有良好的抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌都有较高的抑制作用。
关键词：Perinerin；毕赤酵母；表达；纯化；抗菌活性
Abstract:
Perinerin,apeptidewithbroad-spectrumantimicrobialactivity,wasexpressedandtestedforactivityinPichiapastoris.Firstly,thePerineringenesequencewasobtainedbyPCRamplificationandclonedintothePichiapastorisexpressionvectorpPIC9K.Subsequently,theconstructedexpressionplasmidsweretransformedintoPichiapastorisGS115toachievehighlyefficientexpressionofPerinerin.High-purityPerinerinwaspurifiedusingtheNi2+-NTApurificationmethod,anditspurificationandexpressionwereconfirmedbyproteinelectrophoresisandWesternblot.Finally,theantimicrobialactivityofPerinerinwastestedusingtheWinslowstainingmethodandtheagardiffusionmethod,andtheresultsshowedthatPerinerinhadgoodantimicrobialactivityinPichiapastoris,withhighinhibitoryeffectsonEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,andyeast.
Keywords:Perinerin;Pichiapastoris;expression;purification;antimicrobialactivity
引言：
海蚕（Perinereisaibuhitensis）是一种广泛分布于全球各大洋的多毛类底栖生物，其体内产生的抗菌肽Perinerin，是一种具有广泛抗菌活性和不易产生耐药菌株的肽类分子，因此具有很高的研究和开发价值。然而，在大规模生产Perinerin的过程中，首先需要利用高效的表达系统，如毕赤酵母，来大量生产高纯度的Perinerin，为进一步研究其生物学功能、结构和应用提供有力支持。
材料和方法：
材料：
（1）Perinerin基因全长序列（GenBank编号：KP810953）；
（2）毕赤酵母GS115菌体（Invitrogen）；
（3）pPIC9K载体（Invitrogen）；
（4）LB培养基（1%NaCl、0.5%酵母提取物、1%胰胶、pH7.0）；
（5）YPD培养基（1%酵母提取物、2%葡萄糖、2%胰胨、pH6.0）；
（6）LB平板培养基（1%NaCl、0.5%酵母提取物、1%胰胶、1.5%琼脂、pH7.0）；
（7）SDS-PAGE凝胶（10%）；
（8）Ni2+-NTA树脂（Novagen）；
（9）Winslow染色剂；
（10）大肠杆菌DH5α（Takara）；
（11）金黄色葡萄球菌ATCC25923（ATCC）；
（12）酵母菌Saccharomycescerevisiae（ATCC204508）。
方法：
（1）PCR扩增Perinerin基因全长序列
通过PCR扩增Perinerin基因全长序列，采用以下反应条件：98°C预变性5min，98°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环；72°C最终延伸10min，4°C保温无限制。PCR产物纯化后，克隆到pPIC9K载体中。
（2）质粒转化和筛选
将重组质粒转化到毕赤酵母GS115中，利用