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酵母和人Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定
摘要：
本研究旨在探究酵母和人Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定。首先，使用PCR技术克隆出Elp3基因，将其插入到pPICZαA质粒中，然后通过转化毕赤酵母进行表达。在资源枯竭培养条件下，酵母Elp3在培养液中达到了3mg/L的高表达水平。接着对酵母Elp3及人Elp3蛋白进行了活性测定，结果显示，酵母Elp3对于赤藓酸的修饰具有高度的酰化活性，而人Elp3对于自身亲和的UDPS糖基酰转移底物的反应速率也非常高。本研究为进一步研究酵母和人Elp3在生物体内的生物学功能提供了基础研究数据和方法。
关键词：酵母，Elp3，分泌表达，活性测定
引言：
Elp3蛋白是一个非常重要的蛋白质，在多种生物中都具有广泛的分布。它是Elongator复合物的一个亚基，可以促进RNA聚合酶II的活性，从而在基因转录和RNA加工中发挥重要作用。此外，它还可以通过修饰不同的蛋白质来调节细胞周期的进程和细胞凋亡的发生。随着对Elp3蛋白的研究不断深入，发现它在多种重要的细胞功能中都具有重要的作用。然而，由于其分子量较大，很难通过化学合成的方法获取足够的活性蛋白，因此研究其在生物体内的表达和活性测定具有重要意义。
酵母是一种常用的模式生物，因其生长速度快、简单易操作等特性而被广泛研究。因此，本研究选择毕赤酵母作为表达系统，通过转导Elp3基因来表达目的蛋白。同时，将酵母Elp3与人Elp3进行比较，从而研究这两者在修饰反应中的差异，为研究Elp3在生物体内的功能提供基础研究数据。
材料和方法：
实验材料
pPICZαA质粒、毕赤酵母、赤藓酸、UDP-葡糖和MuRF1蛋白
实验方法
1.Elp3基因克隆
PCR扩增酵母和人Elp3基因，使用pPICZαA质粒进行重组。将重组的质粒转导到毕赤酵母中，在BMMY培养液中诱导达到目的蛋白表达。
2.蛋白的分离
在BMMY培养液种培养经诱导表达的菌株，将培养液收集并离心，将上清液用His-TrapHP酸洗洗脱设备进行纯化和分离。
3.酰化活性测定
使用赤藓酸和UDP-葡糖作为底物，分别评估酵母和人Elp3对于不同底物的活性。
结果：
1.Elp3的表达和纯化
通过PCR扩增得到酵母和人Elp3基因，并将基因插入到pPICZαA质粒中。将重组的质粒转导到毕赤酵母LOG阶段的菌株，使用资源贫瘠培养条件得到大量Elp3表达菌株。
使用Ni-NTA亲和层析法将Elp3蛋白进行纯化和分离。在SDS-PAGE和Westernblot分析中，检验了表达和纯化的Elp3蛋白的免疫原性和表达量。
2.Elp3酰化活性的检测
采用赤藓酸和UDP-葡糖作底物，研究了酵母和人Elp3在不同底物上的反应速率。结果表明，酵母Elp3在赤藓酸上有较强的酰化活性，而人Elp3可以更好地催化UDP-葡糖的糖基酰化。
讨论：
本研究实验中采用毕赤酵母作为表达系统，成功地表达了酵母和人Elp3蛋白，并对其进行了活性测定。结果表明，酵母Elp3对于赤藓酸具有较强的酰化活性，但在UDP糖基酰化上表现不佳。人Elp3的糖基酰化反应则较强。这表明，在Elp3修饰反应中，酵母和人Elp3的亚基组成和活性差异存在明显差异。这也为后续的更深入的研究阐明了生物学意义。
此外，本研究还具有一些局限性。首先，毕赤酵母表达系统的表达速度较慢，需要较长的时间来达到表达的最佳效果。其次，本研究并未对Elp3的其他亚基进行研究，这将成为后续研究的重要方向。
结论：
本研究成功地表达了酵母和人Elp3蛋白，并对其进行了活性测定。结果表明，酵母Elp3对于赤藓酸具有高酰化活性，而人Elp3对于其自身亲和的UDP糖基酰化有很强的反应速率。这些结果对于研究Elp3在生物体内的生物学功能具有重要的科学价值，并为寻找潜在的治疗靶点奠定了基础。