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蝉新型抗菌肽Cryptonin在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性研究
摘要
蝉新型抗菌肽Cryptonin来源于蝉的消化系统，具有广谱的抗菌活性。本研究通过基因工程技术在毕赤酵母中成功表达了Cryptonin。通过对表达产物的鉴定，确定了其分泌表达，并进一步对其生物活性进行研究。研究结果表明，毕赤酵母表达的Cryptonin具有较高的生物活性，并具有较好的可溶性和稳定性，为其在工业生产和医学应用等领域的应用开展了新的研究。
关键词：蝉新型抗菌肽；Cryptonin；毕赤酵母；分泌表达；生物活性
引言
抗菌肽是免疫系统中一类重要的抗菌物质，广泛存在于动植物及微生物体内。它们具有广谱、高效、非特异性、快速作用等优点，在维持生态平衡、保持健康等方面发挥着重要作用[1-3]。蝉新型抗菌肽Cryptonin是一种新型的抗菌肽，来源于蝉的肠道中[4]，其主要结构域是α-螺旋结构和无规卷曲区结构。研究表明，Cryptonin具有较强的抗菌活性，对多种细菌和真菌均有高效的杀菌作用[5-7]。
毕赤酵母（Pichiapastoris）是一种常用的重组蛋白表达宿主，具有分泌表达能力，表达的产物可以直接分泌到培养基中[8-10]。因其易于操作、产量高、纯化简单等优点，被广泛应用于工业和医学等领域。在本研究中，我们尝试使用毕赤酵母作为表达宿主，实现Cryptonin的表达和分泌，并进一步对其生物活性进行研究。
材料与方法
材料
Cryptonin基因（GenBank:KX915849）；毕赤酵母菌株GS115；pPIC9K载体；限制性内切酶、T4DNA连接酶、菌落PCR引物等常用试剂。
方法
1.Cryptonin基因的克隆
从蝉肠道中提取总RNA，采用RT-PCR方法将Cryptonin基因扩增出来，并克隆到pPIC9K载体上。
2.毕赤酵母转化
用电击法将重组质粒pPIC9K-Cryptonin转化到毕赤酵母菌株GS115中，筛选得到阳性菌落。
3.Cryptonin的表达
在酵母表达液中添加0.5%的甲醇诱导表达，将表达产物通过SDS-PAGE检测。
4.Cryptonin的分泌表达
在表达过程中，通过测量培养基中的Cryptonin含量，确定其是否为分泌表达，并通过Westernblot检测其分泌表达的情况。
5.Cryptonin的生物活性检测
通过MTT法、菌落计数法等方法对表达产物的生物活性进行检测，并比较其与天然Cryptonin的差异。
结果
1.Cryptonin基因的克隆
通过RT-PCR方法扩增得到Cryptonin基因，并将其成功克隆到pPIC9K载体上，得到重组质粒pPIC9K-Cryptonin。
2.毕赤酵母转化
用电击法将重组质粒转化到毕赤酵母菌株GS115中，筛选得到阳性菌落。
3.Cryptonin的表达
添加甲醇诱导表达后，通过SDS-PAGE检测得到了表达产物，其相对分子质量与天然Cryptonin相似。
4.Cryptonin的分泌表达
通过测量培养基中Cryptonin的含量和Westernblot检测，确定了表达产物为分泌型。
5.Cryptonin的生物活性检测
通过MTT法、菌落计数法等方法对表达产物的生物活性进行检测，发现毕赤酵母表达的Cryptonin具有较高的生物活性，与天然Cryptonin相比无明显差异。
讨论
本研究成功地在毕赤酵母中实现了蝉新型抗菌肽Cryptonin的表达和分泌表达，并对其生物活性进行了初步研究。在表达过程中，选择了常用的pPIC9K载体，利用电击法将基因转化到毕赤酵母中。通过添加甲醇诱导表达，得到了表达产物，并利用SDS-PAGE检测到其存在。通过测量培养基中的产物含量和Westernblot检测，确定了其为分泌型产物。
在生物活性检测方面，我们利用MTT法、菌落计数法等方法对表达产物的生物活性进行了初步检测，并与天然Cryptonin进行了比较。研究结果表明，毕赤酵母表达的Cryptonin具有较高的生物活性，与天然Cryptonin相比无明显差异。此外，我们还对表达产物的可溶性和稳定性进行了初步考察，发现表达的Cryptonin具有较好的可溶性和稳定性，为其在工业和医学上的应用提供了保障。
总结
本研究成功地在毕赤酵母中表达和分泌了蝉新型抗菌肽Cryptonin，并对其生物活性进行了初步检测。研究结果表明，毕赤酵母表达的Cryptonin具有较高的生物活性，并具有较好的可溶性和稳定性。这为Cryptonin的产业化生产和医学应用提供了重要的基础研究支持。
参考文献
[1]FjellCD,HissJA,HancockRE,etal.SerumamyloidPcomponentbindstobacterialcellwallsandlipopolysaccharid