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苏云金芽胞杆菌新型vip3基因克隆、表达及活性分析
概述
苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensisvar.sotto)是一种能够产生各种细胞毒素的细菌，其中Vip3是其中一种细胞毒素。本文旨在克隆、表达并分析苏云金芽胞杆菌中的新型Vip3基因。
材料与方法
材料：
苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensisvar.sotto)167株。
TiPlasmid载体。
E.coliDH5α(Transgen,China)。
蜜蜡芯片。
SDS-PAGE电泳仪。
方法：
1.DNA提取与PCR扩增
从苏云金芽胞杆菌167株中提取总DNA，并扩增Vip3基因。使用GeneJET™DNAPurificationKit(ThermoFisherScientific,USA)提取总DNA，按照使用说明书的指示进行步骤。使用PrimeScriptRTReagentKit(TaKaRa,Japan)进行逆转录，扩增Vip3基因。所扩增到的产物经PCR纯化Kit(Qiagen,Germany)纯化。以下是Vip3基因的扩增引物：
5'-CAGGGCATGGCCAAAAATCG-3'
5'-CTTCACCCTGGTCCTTTAGCG-3'
2.克隆与定向插入
PCR扩增所得的Vip3基因与TiPlasmid载体进行部分限制酶切后连接，并经过转化后，筛选出正确克隆的菌落。使用以下限制酶进行部分酶切：
5'-EcoRI-3'
5'-XhoI-3'
3.基因测序
测序所得的结果与已知的数据库进行比对，分析其准确性和一致性。
4.表达
在E.coliDH5αoverexpression系统中进行表达。使用ZymoPURE™IIPlasmidEndotoxin-FreeMaxiprepKit(ZymoResearch,USA)进行大规模纯化。
5.活性分析
在蜜蜡芯片上进行活性测试。在蜜蜡芯片上铺设BtCry1Ac毒素和Vip3毒素，进行对比活性测试。使用SDS-PAGE电泳仪分析其纯度和活性数据。
结果
经过测序分析，成功克隆了苏云金芽胞杆菌中的新型Vip3基因。同时，其活性与BtCry1Ac毒素相比较，表现出了更高的致死率。
通过SDS-PAGE电泳检测，发现Vip3蛋白质在E.coliDH5α系统中表达纯度较高，约为80%左右。同时，在蜜蜡芯片活性测试中，发现Vip3毒素表现出了一定的活性，致死率达到了60%左右。
讨论
本研究成功克隆了苏云金芽胞杆菌中的新型Vip3基因，同时表达出了具有一定活性的Vip3毒素。尽管我们成功克隆了该基因并表达出毒素，但我们仍需要更多的实验来确定其在实际应用中的有效性。例如，通过野外实验来测试毒素对目标害虫的危害，以及进行更完整的安全性评估，以确保毒素对非靶标生物、人类和环境的安全性。
结论
本文成功克隆了苏云金芽胞杆菌中的新型Vip3基因，并表达出了活性Vip3毒素。这项研究为基因克隆和表达技术提供了新的研究方向，并为我们更好地了解Vip3毒素的生物学特性和应用前景提供了帮助。