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人端粒酶催化亚基反义RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定
摘要：
本研究成功构建了人端粒酶催化亚基(TERT)基因反义RNA重组腺病毒载体，并进行了鉴定。通过PCR、限制性内切酶切割和DNA测序等方法，检测到TERT基因反义RNA重组腺病毒载体成功构建，且核苷酸序列完整。进一步的实验表明，所构建的反义RNA重组腺病毒载体可以有效抑制TERT的表达，为研究TERT在肿瘤发生发展过程中的调控机制提供了有力的工具。
关键词：端粒酶催化亚基；反义RNA；重组腺病毒；抑制
引言：
端粒酶是一种具有DNA依赖性RNA聚合酶活性的酶，主要作用是在染色体末端合成端粒序列。端粒酶的催化亚基(TERT)是端粒酶催化活性的决定性因素，其在细胞分裂中发挥着重要的作用。TERT的表达水平受到多种因素的调控，如转录因子、肿瘤相关基因等。研究表明，TERT在多种肿瘤中高表达，并与肿瘤的发生、发展、侵袭及预后等密切相关。因此，抑制TERT的表达已经成为治疗肿瘤的重要策略之一。
反义RNA技术是一种常用的基因沉默技术，通过构建与靶基因mRNA互补的反义RNA，以特异性地降低或抑制靶基因的表达。近年来，反义RNA技术被广泛应用于基因功能研究、药物研发等领域。在治疗肿瘤方面，反义RNA具有特异性高、有效性强、可重复性好等优点，被认为是一种非常有前途的新型抗肿瘤药物。
腺病毒是一类广泛应用于基因转移和基因治疗的病毒载体，具有转染效率高、稳定性好等特点。因此，在基因沉默研究中，利用腺病毒载体构建反义RNA表达系统，不仅可以实现高效转染、长期表达，而且可以使靶基因在未被破坏的情况下维持原有的转录后加工而具有较好的仿效性，从而进一步研究其生物学功能。
本研究旨在构建人TERT基因反义RNA重组腺病毒载体，以此为工具研究TERT在肿瘤发生及发展中的调控机制。
材料与方法：
1.材料
（1）TERT基因W3101重组载体（含TERT（NCBIAccessionNo.NM_198253）基因的质粒），购自康泰生物科技有限公司。
（2）pAdTrack-CMV载体，购自康泰生物科技有限公司。
（3）HEK293T细胞株，购自中国科学院细胞生物学研究所。
2.方法
（1）TERT反义RNA序列的设计及合成。
TERT反义RNA的序列设计应尽可能避免与其他基因序列互相匹配，以确保特异性。使用RNAi设计软件对人TERT基因进行反义RNA序列设计，筛选出理想的反义RNA序列，并经过化学合成。
（2）TERT反义RNA重组腺病毒载体的构建。
取pAdTrack-CMV载体和TERT基因W3101重组载体进行酶切，并经PCR扩增纯化得到TERT反义RNA的编码序列。将PCR扩增得到的TERT反义RNA序列与pAdTrack-CMV载体线性化后的载体核酸片段连接，利用关联PCR技术得到重组腺病毒载体。
（3）TERT反义RNA重组腺病毒载体的鉴定。
将所构建的TERT反义RNA重组腺病毒载体进行PCR扩增，并通过限制性内切酶切割和DNA测序方法检测构建成功的反义RNA重组腺病毒载体。然后，将反义RNA重组腺病毒载体转染至HEK293T细胞株，利用Westernblot和RT-PCR技术检测TERT表达水平。
结果：
（1）TERT反义RNA序列设计及合成。
通过使用RNAi设计软件筛选，得到设计合理的TERT反义RNA序列。参考已有文献，选用全合成化学方法进行TERT反义RNA序列的合成，合成的反义RNA品质纯。经电泳检测，大小约为21nt左右。
（2）TERT反义RNA重组腺病毒载体的构建。
利用关联PCR技术成功构建TERT反义RNA重组腺病毒载体，PCR扩增检测结果显示反义RNA编码序列被成功连接到pAdTrack-CMV载体。
（3）TERT反义RNA重组腺病毒载体的鉴定。
限制性内切酶切割和DNA测序结果表明，所构建的子克隆测序结果与设计一致。进行转染实验后，利用Westernblot和RT-PCR技术检测TERT表达水平，发现TERT的表达被显著抑制。
讨论：
本研究成功构建了TERT基因反义RNA重组腺病毒载体，为研究TERT在肿瘤发生发展过程中的调控机制提供了有力的工具。在本研究中，我们设计了特异性高的反义RNA序列，并通过腺病毒载体实现了稳定的基因转染。转染实验进一步结果表明，所构建的反义RNA重组腺病毒载体可以有效抑制TERT的表达，为进一步探究肿瘤细胞生长、增殖及恶性转化过程中TERT的作用提供了新的思路。
尽管本研究构建的反义RNA载体显示了良好的稳定性和有效性，但我们仍需进一步考虑优化载体转染的条件及其长期表达稳定性等问题。未来的研究将继续深入阐明TERT反义RNA载体在肿瘤治疗中的应用前景。