锌指蛋白ZBTB20的重组腺病毒载体的构建和鉴定-豆柴文库

锌指蛋白ZBTB20的重组腺病毒载体的构建和鉴定.docx

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锌指蛋白ZBTB20的重组腺病毒载体的构建和鉴定锌指蛋白ZBTB20的重组腺病毒载体的构建和鉴定引言 Retroviralandlentiviralvectorshavebeenwidelyusedforgenetransferandgenetherapyduetotheirabilitytointegrateintothehostgenomeandstablyexpressthetransgene.However,thesevectorshavelimitationssuchaslowefficiencyandrandomintegrationleadingtosafetyconcerns.Asanalternative,recombinantadenovirus(Ad)vectorshavebeendeveloped,whichhaveahightransferefficiencyandtransientexpressioninawiderangeofcellsandtissueswithoutgenomeintegration.Furthermore,Advectorsaresaferduetotheirinabilitytointegrateintothehostgenome,makingtheriskofinsertionalmutagenesisverylow.Inthisstudy,weconstructedandvalidatedarecombinantAdvectorexpressingzincfingerproteinZBTB20forpotentialgenetherapyapplications. 材料和方法 ConstructionoftherecombinantAdvectorexpressingZBTB20 ThecodingsequenceofhumanZBTB20wasobtainedfromtheNCBIdatabaseandsubclonedintothepAdTrack-CMVexpressionplasmidcontainingthecytomegalovirus(CMV)promoter,thegreenfluorescentprotein(GFP)reportergene,andthehomologousrecombinationsite.TheZBTB20expressioncassettewasthenclonedintothepAdEasy-1plasmidvectorcontainingtheAdgenomesequencetoproducetherecombinantAdvectorthroughhomologousrecombinationinEscherichiacoli.TheresultingvectorwasscreenedforthepresenceoftheZBTB20expressioncassettebyPCRandrestrictionenzymedigestionanalysis. TransfectionandpurificationoftherecombinantAdvector TherecombinantAdvectorwastransfectedintoHEK293Acellsusinglipofectamine2000reagentaccordingtothemanufacturer'sinstructions.Theinfectedcellswerecultureduntilviralcytopathiceffect(CPE)wasobserved.TheAdparticleswereharvestedandpurifiedbycesiumchloridegradientultracentrifugation.ThetiterofthepurifiedAdvectorwasdeterminedusingaplaqueassayonHEK293Acells. ValidationoftherecombinantAdvector ToconfirmtheexpressionofZBTB20fromtherecombinantAdvector,HEK293AcellswereinfectedwiththeAdvectororcontrolAdvectorexpressingGFPalone.TheexpressionofZBTB20wasanalyzedbywesternblottingusingananti-ZBTB20antibody.TheexpressionofGFPwasusedasacontrolforthetransfect

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