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人端粒酶催化亚基反义RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定的中期报告
本研究旨在构建一种基于反义RNA技术的重组腺病毒载体，以实现人端粒酶催化亚基(TERT)的特异性表达和激活，探索其在治疗癌症等疾病中的潜在应用价值。本报告着重介绍该载体的构建和初步鉴定工作。
1.载体构建
基于Ad5质粒pShuttle2-TERT，采用反向PCR技术，设计引物扩增TERT反义RNA序列，并插入至pShuttle2-TERT的多克隆位点中，得到重组质粒pShuttle2-TERT-anti。
进一步采用腺病毒转染系统，将pShuttle2-TERT-anti与Ad5质粒pAdEasy-1共转染至293细胞中，经腺病毒DNA重组和线性化等处理后，得到重组腺病毒载体Ad-TERT-anti。
2.载体鉴定
初步鉴定包括PCR、Westernblot和荧光显微镜检测。
PCR结果显示，重组载体Ad-TERT-anti和对照载体Ad5-TERT均有明显的TERT基因片段扩增产物，而空白对照不产生扩增产物。
Westernblot分析表明，Ad-TERT-anti感染293细胞后，TERT蛋白在细胞内得到表达，且比对照组Ad5-TERT表达量明显增加。
荧光显微镜观察结果表明，Ad-TERT-anti感染293细胞后，TERT蛋白在细胞质和核内出现明显荧光信号，且比对照组Ad5-TERT荧光强度明显增强。
综上所述，本研究成功构建了一种基于反义RNA技术的重组腺病毒载体Ad-TERT-anti，并初步证明该载体能够特异性表达和激活TERT蛋白。下一步计划进一步完善载体构建和优化表达系统，探索其在实际应用中的效果。