造血干细胞分离培养方法.doc

(完整word)造血干细胞分离培养方法(完整word)造血干细胞分离培养方法(完整word)造血干细胞分离培养方法一造血干细胞分离（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备1HES（羟乙基淀粉）沉淀法抽取髓液500mL按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400g离心10min得细胞沉淀物，以1%白蛋白盐水液洗涤细胞2次。2percoll液密度梯度离心法①按体积比为（1。5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液.4℃,1500r/min，离心20min。取单个核细胞层，以1％白蛋白盐水液洗涤3次。②取鼠股骨和胫骨，在两头关节处切开骨骼，反复用培养基冲洗骨髓腔，随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上,2000r/min离心20min.吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。3Ficoll分离法方法一在15ml分离管中加7。5ml比重为1。017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min，吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1：1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上,注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，(后续在冰上进行)用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS,1500rpm×10分钟，L-DMEM洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。取骨髓细胞悬液的方法是:取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min,之后在两头关节处切开骨骼,反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。（二）Linc—-kit+造血干细胞的分离纯化.去除Lin+细胞(负筛选):带有生物素的混合抗体标记成熟细胞；抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞，包括T，B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞;细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞(正筛选）:带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞,细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照Miltenyi公司MACS手册）。(三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液，加入2.5μLCD45—FITC和10μLCD34-PE充分混合，避光孵育15min.以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定，上机检测。磁性标记CD34+细胞：在细胞悬液中加入100μLFc—R阻滞剂,再加入100μLCD34磁珠标记细胞，于4℃冰箱中充分混合孵育30min。用PBS缓冲液洗涤细胞，离心10min,去上清液后再以500μLPBS缓冲液重新悬浮细胞。MiniMACS磁性分离、纯化CD34+细胞：将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500μLPBS缓冲液漂洗。以孔径30μm的尼龙网或过滤器去除细胞悬液凝块，细胞通过分离柱，以500μLPBS缓冲液冲洗3次。将分离柱从分离器中移出并放置在合适的试管中,于分离柱顶端滴注PBS缓冲液1mL,用分离柱配备的活塞加压将保留的细胞冲出。重复磁性分离步骤，将洗脱的细胞移至一个新的漂洗过的MS分离柱洗涤,用500μLPBS缓冲液洗脱保留的细胞.二造血干细胞培养1粒—巨噬细胞集落生成单位（GFU-GM）培养（CD34+细胞的培养）采用甲基纤维半固体培养基体系进行集落培养.培养体系中含有50μg/L重组干细胞生长因子(rhSCF）、10μg/LrhGM-CSF、10μg/L重组白细胞介素(rhIL)-3。在1mL培养体系中加入1×105个有细胞。5%CO2，37℃条件下培养14d，倒置显微镜下计数CFU—GM集落数。2MNCs与HSCs的体外培养MNCs体外培养:用含10%小牛血清的高糖DMEM培养基培养，MNCs以5×104个/mL接种于24孔板中，每孔1mL；（2）HSCs体外培养:用无血清高糖DMEM培养基，HSCs以1×104个/mL接种于24孔板中。细胞均置37℃,5％CO2饱和湿度培养箱中培养。3由MNC制备基质细胞层取新鲜分离的单个核细胞1×106培养于1ml含10%胎牛血清的IMDM中,置于24孔培养板中,于5％CO2，37℃饱和湿度的CO2孵育箱中，每7天半量换液1次，3周后培养孔底铺满了基质细胞，去除悬浮细胞,用PBS洗2遍后，用含有EDTA的胰蛋白酶消化，1500RD照射后将