线粒体分离纯化方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115948462A(43)申请公布日2023.04.11(21)申请号202211010200.6(22)申请日2022.08.23(71)申请人南开大学地址300071天津市南开区卫津路94号(72)发明人沈月全徐祥鲁徐航(74)专利代理机构天津诺德知识产权代理事务所(特殊普通合伙)12213专利代理师王旭(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)C12N15/62(2006.01)C12N5/10(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图2页(54)发明名称线粒体分离纯化方法(57)摘要本发明公开一种线粒体分离纯化方法，构建能够产生连接有标签的线粒体的细胞，破碎研磨后，采用能够连接标签的磁珠结合研磨液中的线粒体，洗脱后得到纯化线粒体。本发明的有益效果是：采用匀浆研磨的方法，降低了分离得到的线粒体中细胞碎块的含量，通过磁珠结合洗脱的方式，能够大幅提高线粒体的纯度；本方案中无需使用超高速离心机，该方法适用范围较广，操作简便易行，具有很强的可操作性和实用性；另外通过本方案分离得到的线粒体，能够最大限度保留线粒体功能和活性，为后续研究提供稳定的研究基础。CN115948462ACN115948462A权利要求书1/1页1.线粒体分离纯化方法，其特征在于：构建能够产生连接有标签的线粒体的细胞，破碎研磨后，采用能够连接所述标签的磁珠结合研磨液中的线粒体，洗脱后得到纯化线粒体。2.根据权利要求1所述的线粒体分离纯化方法，其特征在于：具体步骤如下：构建含有线粒体膜蛋白基因和标签的质粒，细胞转染后细胞培养；收集细胞后研磨匀浆；将磁珠与匀浆液混匀结合，离心后取沉淀；洗脱磁珠上的线粒体，得到纯化后的线粒体。3.根据权利要求1或2所述的线粒体分离纯化方法，其特征在于：标签为2×Strep；磁珠为Strep‑Tactinbeads。4.根据权利要求2所述的线粒体分离纯化方法，其特征在于：构建的质粒中所包含的线粒体膜蛋白基因为OMP25、TOM20或TOM40。5.根据权利要求2所述的线粒体分离纯化方法，其特征在于：研磨细胞时加入bufferA，bufferA包括136mMKCl、10mMKH2PO4和20mMNaCl，pH＝7.3。6.根据权利要求5所述的线粒体分离纯化方法，其特征在于：洗脱线粒体时加入bufferB，bufferB包括bufferA和2.5mM脱硫生物素。7.根据权利要求2所述的线粒体分离纯化方法，其特征在于：磁珠与匀浆液混合体积比为3：160。8.根据权利要求2所述的线粒体分离纯化方法，其特征在于：磁珠加入到离心后取上清的匀浆液中。9.通过权利要求1‑8中任一所述的线粒体分离纯化方法分离得到的线粒体。2CN115948462A说明书1/4页线粒体分离纯化方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种线粒体分离纯化方法。背景技术[0002]线粒体是真核生物细胞内重要的细胞器,是细胞能量代谢和氧代谢的场所,参与氧化磷酸化,三羧酸循环,储存钙离子等,同时线粒体也是物质转化的中枢,在生物分子合成、物质转运上发挥重要作用。此外,线粒体在细胞/个体的生长发育、衰老、病变、死亡以及进化等多方面扮演重要角色。目前已发现线粒体基因、结构和功能异常与衰老、肿瘤、心血管病、糖尿病及神经退行性疾病等100多种疾病相关。线粒体功能研究已成为细胞生物学领域重要研究热点之一。[0003]线粒体功能的研究需要纯化的,高活性的线粒体。目前科学研究中用到的线粒体分离方法主要为蔗糖密度梯度离心法或商品化的线粒体分离试剂盒,前者需要超高速离心机，一般实验室不具备,并且步骤繁琐用时较长,得到的线粒体活性较差,后者虽然大大缩减了提取时间但所提线粒体纯度较低,常含有其他细胞成份,如糖原、细胞碎片等。常常导致实验失败或结果不稳定、重复性差。发明内容[0004]为解决上述技术问题，本发明提供一种线粒体分离纯化方法。[0005]本发明采用的技术方案是：线粒体分离纯化方法，构建能够产生连接有标签的线粒体的细胞，破碎研磨后，采用能够连接标签的磁珠结合研磨液中的线粒体，洗脱后得到纯化线粒体。[0006]优选地，具体步骤如下：[0007]构建含有线粒体膜蛋白基因和标签的质粒，细胞转染后细胞培养；[0008]收集细胞后研磨匀浆；[0009]将磁珠与匀浆液混匀结合，离心后取沉淀；[0010]洗脱磁珠上的线粒体，得到纯化后的线粒体。[0011]优选地，标签为2×Strep标签；磁珠为Strep‑Tactinbeads；[0012]优选地，构建的质粒中所包含的线粒体膜蛋白基因为OMP25、TOM20或TOM40。[0013]优选地，研磨细胞时加入bufferA，bufferA包括136mMKCl