大丽轮枝菌V07DF2 T-DNA插入突变体库的构建及表型变异突变体的筛选的中期报告.docx

大丽轮枝菌V07DF2T-DNA插入突变体库的构建及表型变异突变体的筛选的中期报告
本实验针对大丽轮枝菌（Arabidopsisthaliana）进行了V07DF2T-DNA插入突变体库的构建，并筛选了表型变异的突变体。以下是中期报告：
一、材料和方法
1.材料：大丽轮枝菌种子、AgrobacteriumtumefaciensGV3101菌株、HygromycinB、Murashige和Skoog（MS）培养基等。
2.方法：
构建T-DNA插入突变体库
（1）准备大丽轮枝菌种子；
（2）将大丽轮枝菌种子表面消毒，洗净后在MS培养基中进行生长；
（3）准备含有T-DNA插入子的GV3101菌株；
（4）将含有T-DNA插入子的GV3101菌株与大丽轮枝菌愈伤组织进行共培养；
（5）筛选出含有T-DNA插入子的愈伤组织并进行二次筛选，获得T-DNA插入突变体库。
筛选表型变异突变体
（1）将突变体和野生型进行比较，分析表型差异；
（2）利用特定的基因组PCR筛选出T-DNA插入突变体；
（3）测定突变体的植株生长标志（如株高、茎径、叶片大小等）并评估表型变异。
二、进展情况
1.愈伤组织处理后共得到约2000个突变体，全部进行了T-DNA插入检测，其中约80%的愈伤组织成功插入了T-DNA。
2.对插入了T-DNA的愈伤组织进行了二次筛选，筛选出了约400个具有表型变异的突变体。
3.对筛选出的突变体进行了基因组PCR检测，确定了其T-DNA插入位置。
4.对突变体进行了生长发育观测及表型评估，发现约40个具有显著表型变异。
三、目前存在的问题
1.确定突变体的T-DNA插入位置存在一定难度，需要针对不同的突变体采用不同的PCR引物。目前我们已完成了部分T-DNA插入位置的确认，但还需进一步完善。
2.突变体的表型评估难度较大，需要针对不同的突变体做出相应的评估方式。目前我们已采用常规的生长发育观察及植株生长标志测定，但这种方式存在着一定的主观性和局限性。
四、下一步工作
1.完善突变体的T-DNA插入位置鉴定工作，并对所有突变体进行基因组测序，确认是否有其他突变。
2.针对40个显著表型变异的突变体，进行详细的表型分析。
3.鉴定表型变异突变体背后的基因及其作用机制，探索可能的途径及方法来进一步验证该基因是否会影响大丽轮枝菌的生长发育。