大丽轮枝菌VdKu80基因敲除突变体菌株，其构建方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106399133A(43)申请公布日2017.02.15(21)申请号201610821907.3(22)申请日2016.09.13(83)生物保藏信息CGMCCNo.128732016.08.17(71)申请人北京林业大学地址100083北京市海淀区清华东路35号(72)发明人田呈明熊典广王永林邓成霖(74)专利代理机构北京元本知识产权代理事务所11308代理人喻蓉(51)Int.Cl.C12N1/15(2006.01)C12N15/80(2006.01)C12R1/645(2006.01)权利要求书2页说明书15页序列表8页附图4页(54)发明名称大丽轮枝菌VdKu80基因敲除突变体菌株，其构建方法及其应用(57)摘要本发明提供了一株敲除VdKu80基因的大丽轮枝菌突变体菌株、其构建方法及其应用，并评估了该突变体菌株在大丽轮枝菌基因功能研究中的适用性。本发明构建VdKu80基因敲除载体片段，通过PEG介导的原生质体遗传转化，从转化子中筛选并鉴定得到单拷贝敲除VdKu80基因的大丽轮枝菌突变体菌株VdXS11-△VdKu80。本发明的敲除VdKu80基因的大丽轮枝菌突变体菌株在生长速率、菌落形态、压力响应、分生孢子产量、微菌核形成和致病性表型与野生型菌株无显著差异。使用本发明的突变体菌株作为受体菌株进行基因敲除，其基因敲除率比野生型菌株提高了20％以上，因此能够作为受体菌株对大丽轮枝菌其他基因进行敲除实验。CN106399133ACN106399133A权利要求书1/2页1.大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)的VdKu80基因敲除突变体菌株VdXS11-△VdKu80，其特征在于，所述微生物保藏号为CGMCCNo.12873。2.如权利要求1所述的大丽轮枝菌VdKu80基因敲除突变体菌株，其特征在于，所述VdKu80基因被潮霉素抗性基因所替代。3.如权利要求1所述突变体菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)利用Split-marker方法构建大丽轮枝菌VdKu80基因敲除载体；2)利用PEG介导的方法，将VdKu80基因敲除载体导入野生型大丽轮枝菌的原生质体内，获得大丽轮枝菌VdKu80基因敲除的转化子；3)利用PCR方法对大丽轮枝菌VdKu80基因敲除转化子进行筛选。4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述构建大丽轮枝菌VdKu80基因敲除载体为VdKu805F+2/3Hyg片段和2/3Hyg+VdKu803F片段。5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述大丽轮枝菌VdKu80基因敲除载体按照如下步骤构建而成：1A)以大丽轮枝菌基因组DNA为模板，分别以2对PCR扩增特异性引物Ku80-5F/Ku80-5R、Ku80-3F/Ku80-3R为引物进行PCR扩增，获得大丽轮枝菌VdKu80基因上游片段VdKu805F和下游片段VdKu803F；1B)以质粒gGFP为模板，以Hyg-For/Hyg-Rev为特异性引物进行PCR扩增，获得潮霉素抗性基因片段Hygromycin片段；1C)将VdKu805F、VdKu803F片段和Hygromycin片段分别与pMDTM19-TVector质粒进行连接反应，获得VdKu805F重组质粒、VdKu803F重组质粒和Hygromycin重组质粒；1D)以VdKu805F重组质粒为模板，以Ku80-5F/Ku80-5RO为引物，进行PCR扩增得到VdKu805FO片段；以VdKu803F重组质粒为模版，以Ku80-3FO/Ku80-3R为引物，进行PCR扩增得到VdKu803FO片段；以Hygromycin重组质粒为模版，以M13F/M13R为引物，进行PCR扩增得到HygromycinO片段；1E)以VdKu805FO片段和HygromycinO片段为模板，以Ku80-5F/HY-R为引物，进行融合PCR扩增，获得大丽轮枝菌VdKu80基因敲除载体1：VdKu805F+2/3Hyg片段；以VdKu803FO片段和HygromycinO片段为模板，以YG-F/Ku80-3R为引物，进行融合PCR扩增，获得大丽轮枝菌VdKu80基因敲除载体2:2/3Hyg+VdKu803F片段。6.如权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述野生型大丽轮枝菌菌株为大丽轮枝菌XS11菌株。7.如权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，步骤3)中所述PCR方法筛选大丽轮枝菌VdKu80基因敲除转化子包括如下步骤：3A)使用CTAB法提取大丽轮枝菌VdKu80基因敲除转化子的DNA；3B)以步骤3A)提取的DNA为模板，以Ku80-IF/Ku80-IR为引物