大肠菌群平板计数法方法学验证报告.doc

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GB4789.3-2016大肠菌群平板计数法方法学验证报告

验证目的
验证GB4789.3-2016《食品微生物学检验大肠菌群计数（大肠菌群平板计数法）》在本实验室的适用性。
二、验证方法
本实验样品取不同不同类型产品进行实验，严格按照GB4789.3-2016进行，本实验方法设计如下：
样品种类样品名称样品编号实验人员实验方法包装饮用水xxxxxxc、b双人双平行乳粉xxxxxxc、a双人双平行豆制品xxxxxxa、b双人双平行除上述实验程序外，为保证本次验证的科学性和准确性，本次实验添加阳性对照组，对照组由标准菌株大肠埃希氏菌（CICC10389）接种培养而成，与样品实验程序同时进行。
三、验证设备和试剂
冰箱：BCD-212DG/A海信（北京）电器
生化培养箱：LRH-70上海一恒科学仪器
电位pH计：PHS-3C+（精确度0.01）成都世纪方舟科技有限公司
无菌均质器：SCIENTZ-04宁波新芝生物科技有限公司
恒温振荡器：SHA-A江苏金坛环宇科学仪器厂
菌落计数仪：Scan-500北京五洲东方科技发展有限公司
天平:JE-502上海浦春计量仪器有限公司
超净工作台:SW-CJ-2FD上海博迅实业
显微镜：B203LED重庆奥特光学仪器有限公司
培养基和试剂：
结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）北京陆桥技术股份有限公司
煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤北京陆桥技术股份有限公司
无菌生理盐水：同GB4789.3项下制法。
四、验证环境
依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录；
依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、超净台进行清洁消毒灭菌并记录；
依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室及超净台进行沉降菌检测并记录；
无菌室检验：详见《xxxx》；
五、验证步骤
样品的稀释
1.1固体和半固体样品：称取25g样品放入盛有225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。
1.2液体样品：以移液枪吸取25mL样品置盛有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
1.3样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。1.4用1mL微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL生理盐水的无菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
选取2个～3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照，取1ml阳性菌液加入无菌平皿作阳性对照。
及时将15mL～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h～24h。
平板菌落数的选择
选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以4中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。
六、验证结果
实验结果如下表所示，详细实验结果见《食品中大肠菌群平板计数检验原始记录（2010）》。
表1：大肠菌群平板计数检验（2010）实验结果统计表
组别样品名称
和编号实验员实验结果平行误差两组误差一组A
XXXXc5个样品结果均小于m值（m=0CFU/mL）无明显差异无明显差异c5个样品结果均小于m值（m=0CFU/mL）二组b5个样品结果均小于m值（m=0CFU/mL）无明显差异b5个样品结果均小于m值（m=0CFU/mL）一组B
XXXXa5个样品结果均小于m值（m=10CFU/g）无明显差异无明显差异a5个样品结果均小于m值（m=10CFU/g）二组c5个样品结果均小于m值（m=10CFU/g）无明显差异c5个样品结果均小于m值（m=10CFU/g）一组C
XXXXa2个样品结果位于m和M值之间