大肠菌群测定方法学验证报告.doc

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GB/T4789.3-2003大肠菌群测定方法学验证报告

一、验证目的
验证GB/T4789.3-2003《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群测定》在本实验室的适用性。
二、验证方法
严格按照GB/T4789.3-2003进行实验，本实验方法设计如下：
样品种类样品名称样品编号实验人员实验方法糕点xxxxxxa、b双人双平行蜜饯xxxxxxc、a双人双平行汽水xxxxxxc、b双人双平行除上述实验程序外，为保证本次验证的科学性和准确性，本次实验添加阳性对照组，对照组由标准菌株大肠埃希氏菌（CICC10389）接种培养而成，与样品实验程序同时进行。
三、验证设备和试剂
冰箱：BCD-212DG/A海信（北京）电器
生化培养箱：LRH-70上海一恒科学仪器
电位pH计：PHS-3C+（精确度0.01）成都世纪方舟科技有限公司
无菌均质器：SCIENTZ-04宁波新芝生物科技有限公司
恒温振荡器：SHA-A江苏金坛环宇科学仪器厂
菌落计数仪：Scan-500北京五洲东方科技发展有限公司
天平:JE-502上海浦春计量仪器有限公司
超净工作台:SW-CJ-2FD上海博迅实业
显微镜：B203LED重庆奥特光学仪器有限公司
培养基和试剂：
乳糖胆盐发酵管北京陆桥技术股份有限公司
伊红美蓝琼脂北京陆桥技术股份有限公司
乳糖发酵管北京陆桥技术股份有限公司
革兰氏染液和无菌生理盐水
四、验证环境
依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录；
依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、超净台进行清洁消毒灭菌并记录；
依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室及超净台进行沉降菌检测并记录；
无菌室检验：详见《XXXX》；
五、验证步骤
检样稀释
1.1以无菌操作将检样25g（ml）放于含有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃容器内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。
1.2用1mL移液枪吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
1.3按1.2操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸头。
1.4根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种三管，单料乳糖胆盐和双料乳糖胆盐阳性对照和空白对照各接种一管。
乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置36℃±1℃生化培养箱内，培养24h±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，置36℃±1℃生化培养箱内，培养18h~24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。
证实试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌落1个~2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃生化培养箱内培养24h±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
结果与报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
六、验证结果
实验结果如下表所示，详细实验结果见《食品中大肠菌群MPN计数检验原始记录（2003）》。
表1：大肠菌群MPN计数检验（2003）实验结果统计表
组别样品名称
和编号实验员实验结果平行误差两组误差一组A
XXXXa＜30MPN/100g无明显差异无明显差异a＜30MPN/100g二组b＜30MPN/100g无明显差异b＜30MPN/100g一组B
XXXXa＜30MPN/100g无明显差异无明显差异a＜30MPN/100g二组c＜30MPN/100g无明显差异c＜30MPN/100g一组C
XXXXc＜3MPN/100ml无明显差异无明显差异c＜3MPN/100ml二组b＜3MPN/100ml无明显差异b＜3MPN/100ml
经过该方法的双人双平行论证，从表1可看出，糕点-银海草子糕、蜜饯-成果派铁山楂、汽水-雪碧汽水的平行误差和两组人员误差无明显差异，符合要求。因此可认为GB/T4789.3-2003《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群测定》在检测糕点、蜜饯、汽水的实验中准确可靠，可在本实验室适用，以此