九种单核细胞增生性李斯特菌检测技术-效果比较及评价.pdf

中国生物工程杂志ChinaBiotechnology，2012，32(6):84-92

九种单核细胞增生性李斯特菌检测技术
效果比较及评价

刘雅莉1，2刘芳3韩舜愈1刘箐2*孙志博4夏俊芳1朱小清5

(1甘肃农业大学食品科学与工程学院兰州7300702上海理工大学医疗器械与食品学院上海200093)
(3甘肃出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心兰州7300204兰州大学基础医学院兰州730000)
(5甘肃出入境检验检疫局兰州730020)

摘要采用传统生物学方法、显色培养基方法、自制三抗体夹心ELISA试剂盒(TAS-ELISA)、基因
组直接PCR(DNADirect-PCR)、菌裂解直接PCR(BacteriumDirect-PCR)、免疫捕捉PCR(IC-
PCR)、生物PCR(Bio-PCR)、SYBRGreen染料实时荧光PCR(SYBRGreenRealtime-PCR)、探针实
时荧光PCR(TaqManRealtime-PCR)检测纯菌液及模拟带菌食品中的单核细胞增生性李斯特菌
(Listeriamonocytogenes，LM)。结果表明:传统生物学培养方法出现假阳性;TAS-ELISA、DNA
Direct-PCR、BacteriumDirect-PCR、IC-PCR最低检测限分别为106、102、105、104CFU/ml;显色培养
基、SYBRGreenRealtime-PCR灵敏度达102CFU/ml;Bio-PCR、TaqManRealtime-PCR检测灵敏度
最高，均为101CFU/ml。显色培养基、TAS-ELISA操作简单，适合大量样品的初检;IC-PCR具有灵
敏、特异、快速、经济的优点，特别适合大体积样品中微量病原的检测;Bio-PCR、TaqManRealtime-
PCR灵敏度高、特异性好，适合阳性样品的复检以及科研使用。
关键词单核细胞增生性李斯特菌三抗体夹心ELISA免疫捕捉PCR生物PCR实时荧光
定量PCR
中图分类号Q819

单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，芯片［10-11］、变性高效液相色谱［12］、色谱-质谱分析［13］
LM)是一种短小的革兰氏阳性无芽胞兼性厌氧杆菌，等。但这些检测技术有些未列入检测标准，有些技术
是李斯特菌属中致病力最强的细菌，也是唯一对人致本身存在缺陷，有些适用范围有限，为了进一步明确这
病的、典型的胞内寄生菌，可以导致严重的人畜共患传些方法的优劣，指导技术人员进行检测方法的选择，从
染病，如脑膜炎、败血症、流产和单核细胞增多等症状。而提高检出率、增加检测的敏感性和特异性、缩短检测
1988年，世界卫生组织(WorldHealthOrganization，周期、减少检测成本，研究结合本实验室近年的研究成
WHO)发表“食源性李斯特菌病劝告书”，指导全世界果，用九种方法检测纯菌液及牛奶、果汁、酸奶、雪糕、
各国如何预防李斯特菌污染和中毒;自此，LM成为新香肠、生猪肉六种模拟带菌食品中的LM，比较并评价
的重要的食源性疾病病原菌，WHO将其与大肠杆菌了各技术的优缺点，明确了不同技术的适用范围。
O157∶H157、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌并列为20
1材料与方法
世纪90年代四大食源性致病菌。目前，针对LM的检
测技术主要有:显色培养基［1］、酶联免疫［2］、胶体金试1．1材料与试剂
纸条、Direct-PCR、免疫捕捉PCR［3］、多重PCR［4-5］、免疫脑心浸液肉汤购于OXOID公司;李斯特显色培养
［］［］［］
磁珠PCR6、生物PCR7、实时荧光定量PCR8-9、基因基购于博赛生物;LM单克隆抗体(ab11439)、多克隆抗
体()购自公司;辣根过氧化物酶购于兰
收稿日期:2012-02-13修回日期:2012-03-22ab20506Abcam
*通讯作者，电子信箱:[e-mail]州鹏程生物公司;过碘酸钠购于Sigma公司;山羊抗兔
2012，32(6)刘雅莉等:九种单核细胞增生性李斯特菌检测技术效果比较及评价85

IgG购于Solarbio公司;DNA提取试剂盒、PCR引物、探5min，35个循环，4℃保存;扩增产物用1．5%琼脂糖凝
针及体系购于宝生物工程(大连)有限公司;SYBR胶电泳后凝胶成像分析。
GreenRealtimePCRMasterMix购于TOYOBO公司;hly1．2．6菌裂解直接PCR(BacteriumDirect-PCR)以
［］
基因(234bp)针对的引物、探针14序列如下:上游5'-不同浓度菌液5μl为模板进行Direct-PCR扩增，其余成
CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3'、下游5'-CCTCCAGAG分同DNADirect