单核细胞增生性李斯特菌prfA缺失株及其亲本株胞外蛋白的比较蛋白质组学.pdf

ResearchPaper研究报告

微生物学报ActaMicrobiologicaSinica
53(4):390－396;4April2013
ISSN0001－6209;CN11－1995/Q
http://journals．im．ac．cn/actamicrocn

单核细胞增生性李斯特菌prfA缺失株及其亲本株胞外蛋白的
比较蛋白质组学

殷月兰，白春光，王国梁，贾艳艳，渠瑾，付红，高云飞，焦新安*
扬州大学，江苏省人兽共患病学重点实验室，扬州225009

摘要:【目的】PrfA蛋白对单核细胞增生性李斯特菌致病过程中毒力基因的表达起着重要调控作用，本文从
蛋白质水平上初步探讨了PrfA的调控功能。【方法】对LM4及LM4ΔprfA的胞外蛋白采用双向凝胶电泳结
合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定技术，进行比较蛋白质组学研究。【结果】发现差异表达的有31
个蛋白点，质谱鉴定成功19个点，对应12种蛋白，其中已知的毒力相关蛋白有:InlC、ActA、LLO，此外还发现
丙氨酸丙氨酰羧肽酶、GW重复表面蛋白、假定转录调节因子、天冬氨酸半醛脱氢酶和一些假定蛋白。采用
实时荧光定量PCR方法对蛋白质组学方法获得的结果进行了验证，结果显示hly、actA、inlC的基因表达量显
著下降，丙氨酰氨羧肽酶、GW重复表面蛋白的mRNA转录水平降低。【结论】PrfA蛋白对毒力岛LIPI-I和
毒力岛LIPI-II中毒力基因的表达具有重要的调控作用，新发现的转录调控因子和假定蛋白的功能有待于进
一步深入研究。
关键词:单核细胞增生性李斯特菌，PrfA，分泌蛋白
中图分类号:Q816文献标识码:A文章编号:0001-6209(2013)04-0390-07

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria质的组成与调控活动规律，因而从蛋白质水平上研
monocytogenes，Lm)是重要的人畜共患李斯特菌病究李斯特菌的生命活动显得尤为重要。
的病原，在食品卫生领域受到广泛关注，该菌的致病在李斯特菌侵袭宿主过程中，分泌蛋白起着十
性与调控因子PrfA蛋白作用下毒力基因的表达有分重要的作用。许多毒力因子是以分泌蛋白的形式
着密切的关系。PrfA是李斯特菌最重要的毒力调存在的，如李斯特菌溶血素蛋白LLO、磷脂酶PI-
控因子之一，对李斯特菌黏附及侵袭宿主细胞、逃逸PLC及PC-PLC等。分析细菌的分泌蛋白对于发现
机体免疫应答中起到调控作用，其在Lm致病中的未知的毒力因子或疫苗候选抗原有重要的作用。基
作用尚未完全阐明。随着对李斯特菌的研究进入后于PrfA的广泛调控作用，本研究通过基础培养基培
基因组学时代，仅通过基因组学信息无法了解该菌养法提取细菌的胞外蛋白并进行蛋白质组学研究，
在特定时间和空间上所表达的全部蛋白质及其存在以期发现prfA缺失株与其亲本株之间的差异，发现
方式，而蛋白质组学技术能在整体水平上研究蛋白新的受PrfA调控的蛋白，为揭示其新的调控机制奠

基金项目:国家自然科学基金(31101841);江苏省科技支撑计划(BE2012367);江苏省自然科学基金(BK2011446)
*通信作者。Tel:[phone];Fax:[phone];E-mail:[e-mail]
作者简介:殷月兰(1971－)，女，山东青岛人，博士，副教授，从事重要人兽共患病原菌的分子致病机理和免疫机理及疫苗预防相关研究。
E-mail:[e-mail]
收稿日期:2012-10-07;修回日期:2012-12-19
殷月兰等:单核细胞增生性李斯特菌prfA缺失株及其亲本株胞外蛋白的比较蛋白质组学．/微生物学报(2013)53(4)391

定基础。1.4二维电泳
根据文献［7］，采用pH4－717cm的IPG胶条
1材料和方法水化聚焦，蛋白上样300μg，上样体积300μL。水
化和等电聚焦设置的程序为:17cm胶条水化13h
1.1材料(17℃)，250V、30min，1000V、2h，10000V、5h，
1.1.1菌株:单核细胞增生性李斯特菌yzuLM4由10000V、60，000V·h，总计80000V·h。等电聚焦后
本室保存提供，LM4ΔprfA由本研究室构建。的IPG胶条在平衡液中平衡30min，转移至12%聚
1.1.2主要试剂:IPG预制胶条、载体两性电解质丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的上端，用垂直电泳系统进
(Bio-LyteAmpholyte)、矿物油均购自Bio-Rad公司;行第2向电泳。采用文献［8］的方法进行考马斯亮
CHAPS、硫脲、尿素、TEMED均购自Amresco公司;蓝染色。
碘乙酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、考马斯亮蓝1.5凝胶的图像分析
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