单核细胞增多症李斯特菌InlC基因缺失株的构建与鉴定.pdf

第33卷第1期石河子大学学报：自然科学版Vol.33No.1
2015年2月JournalofShiheziUniversity：NaturalScienceFeb.2015

DOI：10.13880/j.cnki.65-1174/n.2015.01.009文章编号：1007-7383（2015）01-0045-05
单核细胞增多症李斯特菌
InlC基因缺失株的构建与鉴定

袁兆尤，马勋

（石河子大学动物科技学院，石河子832003）

摘要：为探讨单核细胞增生性李斯特菌（Lm）InlC基因在Lm致病性中的作用，本研究对其进行缺失。以单核细胞增
多症李斯特菌4b血清型临床分离株LM-90SB２DNA为模板，扩增出用于缺失InlC基因的上、下游同源臂。运用
SOE-PCR技术，将上、下游同源臂融合扩增得到△InlC基因缺失片段。将△InlC基因缺失片段与自杀性质粒
pKSV-7连接，构建pKSV7-△InlC质粒。电转pKSV7-△InlC于LM-90SB２感受态细胞中，经过10μg/mL氯霉素和
41℃下连续传代15代，获得单交换重组株，然后在41℃氯霉素中传至第108代，获得双交换重组株，菌液用旁侧
引物进行PCR鉴定，然后30℃无氯霉素条件下连续传代培养30代丢失自杀性质粒并检测其遗传稳定性。结果显
示：获得LM90SB２-△InlC缺失突变株，旁侧引物扩增只有1条1480bp大小的片段，同时，对缺失片段进行测序验
证，结果表明成功对InlC基因进行了缺失，并且缺失株遗传稳定。LM90SB２-△InlC的构建为进一步研究InlC基因
在LM毒力中的作用奠定了基础。
关键词：单核细胞增多症李斯特菌；基因缺失；同源重组；InlC基因；电转化
中图分类号：S852.61;R378.99文献标志码：A

ConstructionandIdentificationofInlC-DeletedStrains
ofListeriamonocytogenes

YUANZhaoyou，MAXun
(CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China)

Abstract:TodeterminetheeffectofInlCgeneonListeriamonocytogenes(Lm)pathogenisis.Theupstreamanddownstream
homologyarmsofInlCgenewereamplifiedfrom4bLM-90SB2.Thetwohomologyarmswasconnectedtogethertogetthe
△InlCfragmentthroughSOE-PCR.The△InlCfragmentwasinsertedintothesuicideplasmidpKSV7toconstructthe
recombinantsuicidevectorpKSV7-△InlC.Therecombinantvectorwastransformedbyelectroporationintothecompetentcellsof
theLm-90SB2.Thepositivetransformantsweresubculturedfor15generationsinChloramphenicol(10μg/mL)at41℃,toget
thesingle-exchangestrain.Thenthestrainwascontinuedtobepassagedtothe108thgenerationintheabsenceof
Chloramphenicolat41℃togetthedouble-exchangestrain,andthedetectionprimerswereusedtoidentifyforthemutant.In
ordertolostplasmidandidentifygeneticstabilityofLM90SB2-△InlC,subculturedwasstilledfor30generationswithout
chloramphenicolat30℃.LM90SB2-△InlCwasconstructed.Thedetectionprimerswereusedtodetectforthemutantwhich
cangetonlyonetargetfragmentof1480bpbyPCR,meanwhile,thesequencetechnologysuccessfullyverifiedthemutant.Atthe
sametime,themutanthadgeneticstab