单核细胞增生李斯特菌中CcpA缺失株的构建及对毒力的影响.pdf

中国生物工程杂志ChinaBiotechnology，2014，34(8):29-34

DOI:10．13523/j．cb．20140805

单核细胞增生李斯特菌中CcpA缺失株的
构建及对毒力的影响*

江黎涵程小龙瞿慧萍黄逸怡王淑佳罗勤＊＊

(华中师范大学生命科学学院武汉430079)

摘要CcpA是革兰氏阳性菌中由ccpA基因编码的介导碳分解代谢物阻遏的全局调控因子。近
年来的研究表明，CcpA不仅参与CCＲ效应，还直接或间接参与病原细菌毒力基因的表达调控。
为探讨CcpA对单核细胞增生李斯特菌(Lm)毒力的影响，应用同源重组方法构建CcpA缺失菌
株。以BLAB/c小鼠为实验动物模型，检测野生株EGDe和缺失株EGDeΔccpA侵染小鼠后的半数
致死剂量和肝脾细菌载菌量，观察小鼠肝脏和脾脏的病理形态变化结果显示:缺失
LD50。CcpA
后，的降低了倍，虽然肝脾细菌载菌量没有显著变化，但对小鼠肝和脾的
LmLD5010EGDe△ccpA
损害更为严重，表明CcpA缺失增强了细菌的毒力，CcpA对Lm毒力基因的表达可能具有间接或
者直接的调控作用。
关键词单核细胞增生李斯特菌毒力半数致死剂量病理形态
CcpALD50
中图分类号Q789

碳分解代谢物阻遏(carboncataboliterepression，或饲料，可引起人和动物的李斯特菌病，造成败血症、
CCＲ)是指在混合碳源发酵时，微生物优先利用速效碳脑膜炎、流产和单核细胞增多等多种病症，死亡率高达
源葡萄糖，其分解代谢物对许多基因的表达产生阻遏20%～30%，因此，Lm被WHO列为重要的食源性致病
或激活作用，从而影响非速效碳源利用的现象。在低菌之一［9］。
GC含量的革兰氏阳性菌中，ccpA基因编码的分解代谢Behari等［10］在1998年首次成功克隆到Lm中
物控制蛋白CcpA(catabolitecontrolproteinA)是介导CcpA的编码基因，并证明该基因的功能与CCＲ效应直
［］
CCＲ效应的主要调控因子1-2。研究表明，CcpA具有接相关。同时，他们也指出Lm的CcpA基因序列与其
多效性功能，不仅参与CCＲ效应，还参与中心碳、氮代它低GC含量的革兰氏阳性菌的CcpA基因序列有很高
谢的调控以及生物被膜的形成等［3］。在一些致病菌如的同源性，暗示Lm中CcpA也可能参与了毒力基因的
猪链球菌(Streptococcussuis)、金黄色葡萄球菌表达调控，但是并没有做相关动物毒性实验来验证其
(Staphylococcusaureus)、艰难梭菌(Clostridium功能。
diFFicile)、产气荚膜梭菌(ClostridiumperFringens)中，本研究运用同源重组方法构建了ccpA基因缺失菌株，
CcpA直接或者间接参与了毒性基因的表达调控［4-7］。比较Lm野生株EGDe和ccpA缺失株EGDeΔccpA对小
单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，简鼠毒力的差异，初步探索CcpA在Lm中的功能以及在
称Lm，以下同)属于李斯特菌属(Listeria)，是一种革兰致病机制中的作用。
氏阳性兼性厌氧杆菌，广泛存在于土壤、河流、淤泥、粪
1材料与方法
便、动物饲料等环境中［8］;通过食用被Lm污染的食品
1．1材料
收稿日期:2014-06-18修回日期:2014-06-29
*国家自然科学基金资助项目(30970111)1．1．1菌株和质粒单核细胞增生李斯特菌野生菌
＊＊通讯作者，电子信箱:[e-mail](血清型1/2a，ATCC35152，EGD的衍生株)和质
30中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol．34No．82014

粒pLSV101均为德国维尔茨堡大学微生物系Werner自美国BD公司。
Goebel教授馈赠;DH5α和pUC18为本实验室保存;T1．1．3实验动物8周龄的健康雄性BALB/c小鼠由
载体(pMDTM18-TVector)购自宝生物工程有限公司。湖北省疾病预防中心提供。
1．1．2主要试剂PCＲmix购自北京康为世纪生物科1．1．4引物表1为本实验中所用引物，由上海赛
技有限公司，T4连接酶、Xbal、PstI等酶购自宝生物工百盛生物工程有限公司合成。根据NCBI中EGDe基
程有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生因序列设计引物，在引物的5'端有酶切位点和保护
化科技有限公司。BHI培养基(BrainHeartInfusion)购碱基。
表1实验中用到的PCＲ引物
Table1PCＲprimersusedinthisstudy

PrimerSequence(5'→3')
P1ccpA-Eco