大丽轮枝菌的致病基因、蛋白及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106905423A(43)申请公布日2017.06.30(21)申请号201510982693.3(22)申请日2015.12.23(71)申请人中国科学院微生物研究所地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院3号(72)发明人郭惠珊张涛(74)专利代理机构北京律和信知识产权代理事务所(普通合伙)11446代理人鲍晓芳武玉琴(51)Int.Cl.C07K14/37(2006.01)C12N15/31(2006.01)C12N15/80(2006.01)C12R1/645(2006.01)权利要求书1页说明书10页序列表8页附图3页(54)发明名称大丽轮枝菌的致病基因、蛋白及其应用(57)摘要本发明涉及一种大丽轮枝菌的致病蛋白，所述蛋白具有导致棉花黄萎病的作用，是如下1)或2)的蛋白质：1)氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的蛋白质；2)将SEQIDNO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大丽轮枝菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。还涉及编码所述蛋白的基因以及所述基因和蛋白的应用。该致病基因、蛋白与大丽轮枝菌导致棉花黄萎病的机理具有紧密联系，通过敲除该致病基因可以降低大丽轮枝菌的致病性。CN106905423ACN106905423A权利要求书1/1页1.一种大丽轮枝菌的致病蛋白，其特征在于，所述蛋白具有导致棉花黄萎病的作用，是如下1)或2)的蛋白质：1)氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的蛋白质；2)将SEQIDNO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大丽轮枝菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。2.一种大丽轮枝菌的致病基因，其特征在于，该基因编码的蛋白具有导致棉花黄萎病的作用，是如下1)至4)中任一所述的基因：1)核苷酸序列如SEQIDNO：1中自5′末端第1-347位、第438-746位、第808-1311位和第1368-2901位所示的基因；2)核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的基因；3)在严格条件下与1)或2)限定的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；4)与1)或2)限定的基因具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。3.含有权利要求2所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。4.如权利要求2所述基因的用途，其特征在于，在大丽轮枝菌中敲除权利要求2所述的基因使大丽轮枝菌的致病性降低。5.一种降低大丽轮枝菌致病性的方法，其特征在于，敲除权利要求2所述的基因，具体包括如下步骤：(1)使用两对引物分别扩增SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示序列，将扩增后获得的片段导入表达载体；(2)通过步骤(1)中获得的含有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示序列的片段的表达载体转化农杆菌；(3)选取转化成功的农杆菌；(4)通过步骤(3)中所述的转化成功的农杆菌转染大丽轮枝菌，选取具有抗性的菌株，即为致病性降低的菌株。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述两对引物序列如下：上游引物1：5’→3’方向：GGGTTTAAUGATGAATACTTCGCACCACG；上游引物2：5’→3’方向：GGACTTAAUGTCAGTGGTGCTGCCATCAA；下游引物1：5’→3’方向：GGCATTAAUACGCAAACCCAGGGCAAAAC；下游引物2：5’→3’方向：GGTCTTAAUAACTCACGCGGCGGGATACT。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中还具体包括如下步骤：通过所述上游引物1及所述上游引物2以大丽轮枝菌基因组DNA为模板PCR扩增SEQIDNO:3所示序列的基因，所述下游引物1及所述下游引物2以大丽轮枝菌基因组DNA为模板PCR扩增SEQIDNO:4所示序列的基因，将扩增后的两种PCR产物都连接到表达载体。8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中通过电击转化的方法将所述含有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示序列的片段的表达载体导入农杆菌感受态细胞。9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中通过将所述农杆菌涂布于含有抗生素的平板上培养，筛选转化成功的菌株。10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)中通过将农杆菌转化后的真菌菌株涂布于含有抗生素的平板上培养筛选转化成功的菌株。2CN106905423A说明书1/10页大丽轮枝菌的致病基因、蛋白及其应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及大丽轮枝菌的致病基因、蛋白及其应用。背景技术[0002]由土壤丝状真菌大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)所引起的棉花黄萎病是一种土壤传播的维管束病害,病原菌变