大丽轮枝菌诱导坏死蛋白基因nep敲除突变株的构建及其功能分析的任务书.docx

大丽轮枝菌诱导坏死蛋白基因nep敲除突变株的构建及其功能分析的任务书
任务书
对于大丽轮枝菌诱导坏死蛋白基因NEP在植物中的功能机制及其在生长发育、环境适应性中的调节作用，已经有许多研究报道。在这些研究中，突变体的制备是非常重要的。因此，本任务书旨在构建大丽轮枝菌诱导坏死蛋白基因NEP敲除突变株，并对其功能进行分析。
一、任务目标
1.构建大丽轮枝菌诱导坏死蛋白基因NEP敲除突变株；
2.对NEP敲除突变株的生长发育、逆境响应、基因表达等方面进行比较分析，探究NEP在这些方面的调节作用；
3.结合已有研究提供的信息，探究NEP参与植物中病害防御、光信号传导等过程的机制。
二、任务内容
1.大丽轮枝菌诱导坏死蛋白基因NEP敲除突变株的构建
在先前的研究中，已经建立了大丽轮枝菌诱导坏死蛋白基因NEP外显子III的T-DNA插入敲除突变株nepIII。本实验将在其基础上，通过遗传交叉，利用CRISPR/Cas9技术敲除NEP剩余的外显子I和II，得到完整的NEP敲除突变体。具体流程如下：
（1）设计CRISPR/Cas9靶向NEP的gRNA序列，利用自身启动子将gRNA序列与Cas9蛋白表达载体转化到农杆菌中；
（2）利用农杆菌介导法将Cas9/gRNA进行基因编辑，并筛选出同源重组植株；
（3）进行单碱基扩增(Sanger测序)和PCR验证，确认NEP敲除突变株。
2.NEP敲除突变株的生长发育及逆境响应
通过比较NEP敲除突变株和野生型的形态、发育及逆境响应，确定NEP在这些方面的调节作用。具体实验内容如下：
（1）测定幼苗时期NEP敲除突变株和野生型的根长、茎长和根系、叶片形态；
（2）在不同的生长条件下测定NEP敲除突变株和野生型对环境逆境的响应，如干旱、盐胁迫等；
（3）通过生长素和赤霉素等荷尔蒙处理后，测定NEP敲除突变株和野生型的生长及形态变化。
3.NEP在基因表达调节中的作用
利用RNA-seq技术对NEP敲除突变株和野生型进行基因表达谱分析，以研究NEP在基因表达调节中的作用和机制。
具体实验步骤如下：
（1）分别从NEP敲除突变株和野生型的叶片上提取总RNA，利用IlluminaHiSeq2500平台进行RNA-seq测序；
（2）将测序结果进行数据质控、过滤、比对和差异表达基因分析，分析NEP在基因表达调节中的作用和机制。
4.NEP在病害防御和光信号传导中的作用机制
依据已有研究，结合本实验结果对NEP在病害防御和光信号传导中的作用机制进行探究，并提出相关假设。具体实验步骤如下：
（1）依据病原菌和光照条件的不同，采用不同的病原菌和光照处理方式；
（2）测定NEP敲除突变株和野生型对病原菌的感染和光照条件的响应情况；
（3）探究NEP在病害防御和光信号传导中的作用机制。
三、实验设计
本实验预计需要4到6个月的时间进行。实验设计如下：
1.大丽轮枝菌诱导坏死蛋白基因NEP敲除突变株的构建（两个月）
（1）设计gRNA合成
（2）构建Cas9/gRNA表达载体
（3）农杆菌介导遗传转化
（4）筛选
2.NEP敲除突变株的生长发育及逆境响应（两个月）
（1）测量形态
（2）盐胁迫、干旱处理
（3）生长素、赤霉素处理
3.NEP在基因表达调节中的作用（一个月）
（1）总RNA的提取、cDNA合成、测序
（2）基因差异表达分析
4.NEP参与病害防御、光信号传导（一个月）
（1）植物感染菌液处理
（2）光照处理
（3）测定病情、相关生理指标
四、实验预期结果
1.成功构建NEP敲除突变株，鉴定出目标基因敲除效果，进一步探究NEP参与植物生长发育、环境逆境响应等方面的作用机制。
2.通过RNA-seq技术对NEP敲除突变株和野生型进行基因表达谱分析，全面探究NEP在基因调节中的作用和机制。
3.结合已知的研究，对NEP参与植物病害防御、光信号传导等过程的作用机制，提出更深刻的假设和探究方向。
五、实验安全
本实验涉及到转化和植物培养等技术，需要注意遵守实验室和相关实验室安全管理规章制度。同时，需要进行转基因生物安全评价和报告，并遵守相关法律法规。