耳聋单倍型基因突变无创检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112126677A(43)申请公布日2020.12.25(21)申请号202011338696.0G16B20/30(2019.01)(22)申请日2020.11.25G16B20/50(2019.01)G16B20/20(2019.01)(71)申请人北京迈基诺基因科技股份有限公司地址101312北京市顺义区临空经济核心区安庆大街9号院12幢A座201(72)发明人伍建姬晓雯王海丽刘娜韩路(74)专利代理机构重庆博瑞泰知识产权代理有限公司50256代理人吴静(51)Int.Cl.C12Q1/6827(2018.01)C12Q1/6883(2018.01)G16B20/40(2019.01)G16B25/20(2019.01)权利要求书3页说明书13页(54)发明名称耳聋单倍型基因突变无创检测方法(57)摘要本申请提供了以孕妇及其丈夫的白细胞的基因组DNA和孕妇的血浆游离DNA检测胎儿耳聋单倍型基因突变的无创检测方法，其中利用GemCode平台将孕妇及其丈夫的基因组DNA制备二代测序文库并将孕妇血浆游离DNA制备文库；以特异性探针捕获杂交；捕获文库通过二代测序平台进行高通量测序，得到测序原始数据；原始数据经过滤、除去低质量、接头序列得到clean数据后，通过分析父母双方的单倍型及胎儿遗传信息，进而确定胎儿的基因型。CN112126677ACN112126677A权利要求书1/3页1.一种用于无创产前检测耳聋基因突变的方法，其特征在于，所述方法步骤包括：（1）从孕妇及其丈夫的白细胞中获取基因组DNA，从孕妇血浆中获取游离DNA；（2）将孕妇及其丈夫的基因组DNA分配到不同的油滴微粒中，利用GemCode平台对长片段序列进行扩增引入barcode序列以及测序接头引物；得到产物片段化、末端修复、连接接头及PCR富集形成二代测序文库；（3）以孕妇血浆游离DNA制备文库；（4）将步骤（2）和（3）制备的文库以特异性探针捕获杂交；（5）捕获文库通过二代测序平台进行高通量测序，得到测序原始数据；（6）原始数据经过滤、除去低质量、接头序列得到clean数据后，通过分析父母双方的单倍型及胎儿遗传信息，进而确定胎儿的基因型。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法为非诊断方法。3.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法中的耳聋基因突变为GJB2、SLC26A4基因突变。4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（4）中的探针设计方法为：获取GJB2、SLC26A4基因全长并向上下游各延伸1Mb，采用RepeatMask软件分析去掉重复序列，从第一个碱基开始截取78bp的序列做探针，再一次往后移动n个碱基，截取78bp的序列做探针，直到最后一个78bp；同时根据参考序列中GC含量的不同，调整探针的密度，探针的密度根据密度公式调整；根据GC含量调整探针密度公式：其中代表某GC含量的探针密度，a代表GC含量为50%时候的探针密度，为20；gc代表GC含量。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针有生物素标记。6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（6）包括：（A）孕妇血浆的原始数据切除接头序列、低质量碱基、过滤小片段并比对到参考基因组的相应位置；（B）完成（A）后，去除由于PCR扩增偏好引起的重复序列，分析数据，得到单核苷酸变异和插入缺失突变相关信息；（C）对所有的SNP和INDEL进行注释，然后筛选掉正常人数据库所有的SNP和INDEL进行注释，然后筛选掉正常人数据库，对错义突变和剪切位点改变进行致病性预测；（D）用10X数据分析软件longranger分别对父母双方的10X数据进行比对，得到父母双方的突变信息；（E）胎儿基因组遗传突变分析。7.根据权利要求6所述的方法，其中步骤（E）包括：（a）父母10X数据按照位点进行合并分类并统计单倍型区域；（b）计算胎儿DNA浓度；（c）母系遗传单倍型分析：根据得到的父母单倍型信息，筛选包含目标基因的单倍体区域，采用基于序贯概率比检验分类的RHDO算法推导胎儿遗传母亲的单倍型；通过估计等位基因之间的剂量平衡性，确定目标基因区域遗传的单倍型块；计算胎儿遗传单倍体块的阈2CN112126677A权利要求书2/3页值公式如下：其中1200为优势比；为当胎儿遗传母亲HapII时，HapI等位基因占比；为当胎儿遗传母亲的HapI时，HapI等位基因占比；当α型SNP进行RHDO分析时，，，其中f为胎儿浓度；备择假设是母亲血浆中HapI含量过多；当β型SNP进行RHDO分析时，，；备择假设是母亲血浆中HapI含量过少；RHDO分析在目标基因突变位点所在单倍型体积累SNP深度的计数，直到突变位点的单倍型被分类；（d）父系遗传单倍型分析为分析父系遗传