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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107058632A(43)申请公布日2017.08.18(21)申请号201710365913.7(22)申请日2017.05.23(71)申请人安徽安龙基因医学检验所有限公司地址230000安徽省合肥市庐阳区工业区阜阳路与北城大道交口A6号1-2层(72)发明人韦玉军李航王娟苏军吴远航(74)专利代理机构杭州君度专利代理事务所(特殊普通合伙)33240代理人王桂名(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书2页说明书6页(54)发明名称一种多重PCR检测三种腹泻病毒用试剂盒及其检测方法(57)摘要本发明属于核酸检测技术领域,具体涉及A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒。本发明公开的一种多重PCR检测三种腹泻病毒用试剂盒,试剂盒内设有阳性对照和阴性对照,还设有用于检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒中一种或多种病原体的多种引物组及探针序列的混合物。与现有技术相比,本发明所涉及的检测试剂盒,避免了不同引物/探针之间互相产生交联的问题,每组引物/探针不会对其他目标和非目标核酸序列产生交叉同源性,可实现一次反应同时检测三种引起腹泻的常见病原体,检测所需时间短,准确性高,为检测实验室提供了有力的检测工具。CN107058632ACN107058632A权利要求书1/2页1.一种多重PCR检测三种腹泻病毒用试剂盒,试剂盒内设有阳性对照和阴性对照,其特征在于:该试剂盒内还设有用于检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒中一种或多种病原体的多种引物组及探针序列的混合物。2.根据权利要求1所述的一种多重PCR检测三种腹泻病毒用试剂盒,其特征在于:用于A组轮状病毒检测的引物序列分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2,Taqman探针序列为SEQIDNO:3,荧光标记为ROX;用于星状病毒检测的引物序列分别为SEQIDNO:4和SEQIDNO:5,Taqman探针序列为SEQIDNO:6,荧光标记为FAM;用于肠道腺病毒检测的引物序列分别为SEQIDNO:7和SEQIDNO:8,Taqman探针序列为SEQIDNO:9,荧光标记为HEX;用于人内标基因检测的引物序列分别为SEQIDNO:10和SEQIDNO:11,Taqman探针序列为SEQIDNO:12,荧光标记为Cy5。3.根据权利要求1所述的一种多重PCR检测三种腹泻病毒用试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括PCR扩增试剂和对照试剂,所述PCR扩增试剂包括PCR反应缓冲液、HAstV/EAdV/RV引物探针混合液和酶系,所述对照试剂包括阴性对照和HAstV/EAdV/RV阳性对照,所述阴性对照为细胞培养液,所述阳性对照为含HAstV、EAdV和RV目的基因片段的质粒菌。4.根据权利要求3所述的一种多重PCR检测三种腹泻病毒用试剂盒,其特征在于:所述PCR反应缓冲液包括5×RT-PCRbuffer和dNTPs,所述HAstV/EAdV/RV引物探针混合液为HAstV/EAdV/RV、内标引物和探针,所述酶系包括DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂。5.三种腹泻病毒的检测方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:1)按下列组成配制PCR反应液(n为反应管数)PCR反应缓冲液1为16μl×n,HAstV/EAdV/RV引物探针混合液为2μl×n,酶系2为2μl×n;(注意:使用前确保PCR反应缓冲液、HAstV/EAdV/RV引物探针混合液充分溶解并混匀,酶系在使用前需离心以确保所有酶集中在底部)2)将反应体系按20μl/管分装至PCR反应管中,将装有PCR反应液的反应管移至样本处理区;3)加样(在样本处理区进行),用带滤芯的吸嘴分别取已处理好的样本、阴性对照、阳性对照上清各5μl分别加到装有PCR反应液的PCR反应管中,盖上管盖,离心数秒后移至扩增检测区;4)荧光定量PCR扩增(在扩增检测区进行),将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测。6.根据权利要求5所述的检测方法,其特征在于:步骤1)的引物的最终使用浓度为0.2uM,探针的最终使用浓度为0.1uM。7.根据权利要求5或6任意所述的检测方法,其特征在于:步骤4)的反应条件包括如下a-g的程序:a:50℃保持25min(逆转录);b:95℃保持5min(热启动);c:95℃维持10s(变性);d:55℃维持15s(退火);2CN107058632A权利要求书2/2页e:72℃维持30s(延伸),进行5个循环(预扩增);f:95℃维持10s(变性);g:60℃维持45s(退火/延伸,采集荧光信号),进行40个循环。3CN107058