表达质粒的构建方法.docx

表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类，其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+,Kan+（3）多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段（4）P/E启动子僧强子（5）Terms终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭，E.col哺乳类细胞表达载体。（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。综上所述，选用质粒(最常用)做载体的5点要求：选分子量小的质粒，即小载体(1-1.5kb)T不易损坏，在细菌里面拷贝数也多(也有大载体)；一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒＜10个。必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr(试一试)。满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性(如Puro、G418)等等。无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。(1)Ampr水解0-内酰胺环，解除氨苄的毒性。tetr可以阻止四环素进入细胞。(3)camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使G418(长那霉素衍生物)失活(5)hygr使潮霉素。失活。第三步：看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第五步：是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。第六步：启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号(1)启动子-促进DNA转录的DNA序列，这个DNA区域常在基因或操纵子编码序列的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子，负调控序列。核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG(起始密码)和SD序列。转录终止序列(终止子)/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down-stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly(A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down-stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly(A)加尾信号。质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA,它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.根据表达宿主不同，构建时所选择的载体也会不同。二、目的基因的获