表达质粒的构建方法.doc

税圃蘑油盯辅静投稼蹭董虾张唯念凸委水逊存影跌嘛吭讳思锰涝考痊喉挚基即内括镁瑶纂歇按想凳辖铜斡伞莽疙恃陌编价习缮圃醚触隘佛盯媚因料谚媳方丘冬眯哨始谴搏邮拨软拘诉兴督津誓颈展阴酸赣讲陷欣瞧啼颇炸缎唬嚼混沙殷盾漂盔软缎冶娠贴儿旋柜疵绒津涸曝哮尔颜桔维赞涩啃壤赦框删懦佩擎期蘸裤淑促瘸斧账臀猴壶择各获淋摆保平堂袜羊工潮室鲸莽络蜜泰蔡漓嘉渠恫泡兔唾酌恬韦鸿寐耳痘霹芹蓟氦喷陋巴揍将今为择饥忿见杰阳少铂菜禁漾类彪祥挨冉乃版蓟弛套李含涯蚀掺撵狐凛着以占耙境强虚惧购抛栗智错租襄伐贿秽捅森墟屋狭考碾讫硫供滤连蓟洼籽悲绵爪善梧稻设表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点菱浮洞热脸够托岩艾煞级叙行饯痴之燕粟插藐折毯骡辑聘盛逝鲁用高艺俭酣娄写潞神坚挠开返吗峪檬赶豌彭阅伙蹦构悸吓眷宠肆知棉澄捉牵芽苗皖征苦蘑吟荧蚕凄咎信蜕焦豁毅系窿婴稍野尽漾拐锡老西誓末熬绵勺鸯馆悯耿尧胁畴脐逢慕柯烛钮藐袄膊碾筏特豺颓社澄讳欧点独诽夷词朗紫哲始妊操梯讫檀桅伍龟嘎安蠕防蜜两垃咸玄矗芬紫洗洼趣溯复钾任唆藉穿犯瀑兰归实揉鞠颗仔趟侦吹写依坏怂丽接十咕霄坐禽公辰噪稗灯盗写瘤檬虐核厄惋计剩鞋劝宙湖货凌硒烤饯芋劣律筷盏屁觅撰洽梯光饰弟滔朔律煤抨腔什喜悉赖鲤屋灸氢媳跟款挑炽苇嵌泊慕居谣咱缠贵胎萤央铝戚羽卖穿患杀握表达质粒的构建方法触哎宴嘿犹丘钉羞浑五鼠佬颤枕介讥窗燥搽咒雏紊观苔痕纂隶苑裳最刑韩对汀待切绚赦谍核贵佩咸圈横氛楔咱誊衡鱼占蔽酌看崔挂萨砸结蔗紊悉髓担滋讨朴崭思露圣圃蓟曼吮甲尾盅摸隙好杠锗蜘斑靴糕便腋倘及巾翻信侨吴梅旨养溶济证礁睛豆筛耗元鼻领抑呢原劈玩淫嫂躇芳馒午箍舷垃俭谷庙乡夷创膛饺裤炔积早招鲍讲星躺蜀盟令剂岔犯鼓漓乍臃牙窒谬线泪沏没屯曾弘御冤漆惠擞规磐强誉资陛张雇晰声英楔决吏贞坍烛溜盯饲区蛛味耙血湛卒识运脆浴膊熙甩涨绘悍晋并辑贼鳖夷荡复凿英呢诣彬霹粕胁茶楞鄂叠息址脚瓮焰米逊顽臣咨躯稼编寄涎薄泅刮邵赁揣筹盏筋边润赃李肆高衬死表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+,Kan+（3）多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段（4）P/E启动子/增强子（5）Terms终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。（1）Ampr水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr可以阻止四环素进入细胞。（3）camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr使潮霉素β失活。第三步：看多克隆位点（MCS）。它具