食品中铜绿假单胞菌检测.ppt

铜绿假单胞菌一、概述铜绿假单胞菌可由多种途径传播，但主要是通过污染医疗器械、用具及带菌医护人员引起医源性感染，因此，对烧伤病房、手术器械及治疗器械应进行严格消毒灭菌，以保证无铜绿假单胞菌的污染。对铜绿假单胞菌感染的治疗，可应用庆大霉素、多粘菌素B和羧苄青霉素。
铜绿假单胞菌抵抗力较其他革兰阴性菌强，56℃1h可杀灭，对很多抗生素具有耐受性。对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素及不良环境抵抗
力强，对化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌强大。二、生物学特性
1.培养特性
本菌属于假单胞菌属，是一种
非发酵革兰阴性无芽孢杆菌，菌体
细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或
短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显
微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。
2．菌体形态
无芽孢，无夹膜，革兰阴性杆菌，有单鞭毛或丛鞭毛，运动活泼。菌体的大小为0.5～1µm×1.5～3.0µm，菌体笔直或弯曲。
3、生化特性
氧化酶和过氧化氢酶阳性。O/F试验为氧化型，还原硝酸盐为亚硝酸盐，分解乙酰胺产生氨。
98％菌株产生水溶性荧光色素。铜绿假单胞菌能液化明胶，酪蛋白水解，但淀粉不水解。90％以上的菌株产生蓝绿色色素。
分解蛋白质能力强，发酵糖类能力较低，氧化分解葡萄糖，产酸不产气，不分解甘露醇、乳糖及蔗糖，能液化明胶，分解尿素，不形吲哚，氧化酶试验阳性，还原硝酸盐产气，靛基质阴性，不产硫化氢。三、致病性
•主要致病物质是内毒素，此外尚有菌毛、荚膜、胞外
酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症
，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内
膜炎、脓胸，还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严
重的流行性腹泻。
•WHO的HACCP评估明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装
饮用水的危害指示菌，可造成婴儿腹泻。尤其是抵抗
力较差的老弱病幼孕人群，饮用含铜绿假单胞菌的瓶
装水很可能导致疾病的发生，患者食入103~104个菌体细
胞即可被侵害。铜绿假单胞菌的生长还将增加亚硝酸
盐的含量-参考文献。国内外污染情况-参考文献
•国内污染情况：
-瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.2％～23.6％；
-瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6％。

•国外污染情况：
-Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单胞菌；
-Rosenberg报告德国1.2％～10.2％的瓶装矿泉水检出铜
绿假单胞菌。

•刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少，但有文献报
道5加仑桶装产品（15～31天的保存期），铜绿假单胞
菌可生长繁殖达到CFU/ml。

•国内卫生标准：0CFU/250ml三、实验室检验原理
将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤，
并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36℃士1℃恒
温箱中培养48h，能够在CN琼脂上生长并产生绿
脓菌素，或者能够在CN琼脂上生长并且氧化酶呈
阳性、紫外光（360±20nm）照射下能发荧光、
能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，
经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。
培养基和试剂
•假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂（低温避光保存）
•金氏B培养基（低温避光保存）
•乙酰胺肉汤
•营养琼脂
•氧化酶试剂
•钠氏试剂（配制好之后低温避光保存）设备和仪器
•玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121℃高压蒸汽灭菌15分钟
•恒温培养箱：36℃±1℃
•紫外灯：波长应为360±20nm
•滤膜：直径47mm，微孔径为0.45μｍ（处理方法：如滤膜未经灭菌，则使用前需先将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤2次～3次，以除去残留溶剂。建议使用一次性无菌滤膜。）
•显微镜：10×～100×
•冰箱：0℃～8℃1213操作步骤-水样过滤
在100级的洁净工作台进行过滤操作。
首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，
将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，
固定好滤器，将250mL水样或稀释液通
过孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过滤
后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上，
平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着
气泡。
1516结果观察

培养20h～24h观察滤膜上菌落的生长
情况并计数，防止因为培养导致菌落过分
生长而出现菌落融合。（40h～48h时更
容易观察产色素情况和荧光情况）。
181920可疑菌落计数情况
•计数所有显蓝色或绿色（绿脓色素）的菌落，初步判定为铜绿假单胞菌。
•计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确定试验。
（在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光下照射，否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导致无法在证实培养基上生长。）
•将其它所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶试验、乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证实验。