人NT-proBNP融合蛋白及其制备方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115838437A(43)申请公布日2023.03.24(21)申请号202211380377.5C12R1/19(2006.01)(22)申请日2022.11.04(71)申请人广州达安基因股份有限公司地址510665广东省广州市高新技术产业开发区香山路19号(72)发明人黄黉蒋析文颜青青汪育泰何祖强(74)专利代理机构上海上谷知识产权代理有限公司31342专利代理师蔡继清(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C12N15/62(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N1/21(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表（电子公布）附图1页(54)发明名称人NT-proBNP融合蛋白及其制备方法和应用(57)摘要本申请公开了一种人NT‑proBNP融合蛋白及其制备方法和应用。本申请中，设计开发了人NT‑PROBNP融合蛋白，并开发了基于基因工程技术的人NT‑PROBNP融合蛋白的制备方法，将经同义密码子偏好性优化的编码人NT‑PROBNP融合蛋白的多核苷酸导入载体，成功构建原核表达质粒，提高了目的蛋白的表达量，具有产量高、生产周期短、表达产物易纯化、成本低等优点；相比天然的了人NT‑PROBNP蛋白，本发明人NT‑PROBNP融合蛋白的稳定性更好，且抗原活性更高。CN115838437ACN115838437A权利要求书1/1页1.一种人NT‑proBNP融合蛋白，其特征在于，所述人NT‑proBNP融合蛋白选自以下任一种：(a)具有如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列的融合蛋白；(b)具有与如SEQIDNO.3所示序列的同源性大于95％的氨基酸序列的融合蛋白。2.一种编码人NT‑proBNP融合蛋白的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：(i)具有如EQIDNO.4所示序列的多核苷酸；(ii)具有与SEQIDNO.4所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求2所述的多核苷酸。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括表达His×6标签的多核苷酸序列。5.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，优选为pET‑28a(+)。6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求3至5中任一项所述的表达载体；或者所述宿主细胞的基因组中整合有如权利要求2所述的多核苷酸。7.一种制备人NT‑proBNP融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：使含有如权利要求1所述的多核苷酸载体转化宿主细胞；培养所述宿主细胞，以表达所述人NT‑proBNP融合蛋白。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，用SB、TB或SOC培养基培养所述的宿主细胞；和/或，培养所述宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养所述宿主细胞时，通过IPTG诱导以表达出目的蛋白。10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的人NT‑proBNP融合蛋白；或者如权利要求2所述的多核苷酸；或者如权利要求3至5中任一项所述的表达载体；或者如权利要求6所述的宿主细胞。2CN115838437A说明书1/9页人NT‑proBNP融合蛋白及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程领域，特别涉及人NT‑proBNP融合蛋白及其制备方法和应用。背景技术[0002]N末端前钠尿肽(NT‑ProBNP)是心衰时较好的心脏标志物，是从氨基酸前体蛋白(pro‑BNP)中的羧基端裂解而来，产生76个氨基酸非活性NT‑proBNP和32个氨基酸具有生物活性的B型钠尿肽(BNP)。NT‑proBNP和含有C端32个氨基酸的具有生物活性的BNP是等摩尔释放，因此二者在心血管系统疾病的诊断、治疗监测和预后方面有着相似的临床应用。[0003]NT‑proBNP主要由心肌组织生成，心肌组织无法从血浆(血清)中纯化，这使得天然NT‑ProBNP多肽制备十分困难。而直接多肽合成成本过高，不利于规模生产。用基因工程制备低分子量多肽，一般采用融合蛋白表达。但是大量的研究发现，由于原核重组表达的蛋白缺乏糖基化，得到的NT‑proBNP蛋白有稳定性差的缺点。因此，本领域尚需开发制备稳定性高的NT‑proBNP蛋白的方法。发明内容[0004]本发明的目的在于提供一种人NT‑PROBNP融合蛋白。[0005]本发明的另一目的在于提供一种人NT‑PROBNP融合蛋白制备方法。[0006]本发明的另一目的在于提供一