重组轮状病毒VP6载体蛋白及其制备.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(10)授权公告号CNCN102643335102643335B(45)授权公告日2014.07.23(21)申请号201210112598.4进展.《中国疫苗和免疫》.2011,第17卷(第2期),169-172.(22)申请日2012.04.17审查员李宁(73)专利权人中国医学科学院医学生物学研究所地址650118云南省昆明市茭菱路935号(72)发明人陈元鼎(74)专利代理机构昆明正原专利商标代理有限公司53100代理人徐玲菊(51)Int.Cl.C07K14/14(2006.01)C12N15/46(2006.01)C12N15/70(2006.01)(56)对比文件WO2009148964A2,2009.12.10,CN1952156A,2007.04.25,潘小霞等.轮状病毒VP_6蛋白免疫学研究权利要求书2页权利要求书2页说明书10页说明书10页序列表5页序列表5页(54)发明名称重组轮状病毒VP6载体蛋白及其制备(57)摘要本发明提供一种重组轮状病毒VP6载体蛋白及其制备，重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因上有下列六个供外源抗原表位基因插入的限制性内切酶位点，不影响VP6蛋白原有的分子结构，保留了VP6蛋白原有所有抗原表位，并都位于蛋白分子的表面，可最大限度的展示外源抗原表位免疫学性质，以便将其他病毒的抗原表位插入本发明的重组轮状病毒VP6载体蛋白中，从而构建出轮状病毒RV与其他病毒联合重组的嵌合疫苗及试剂。CN102643335BCN1026435BCN102643335B权利要求书1/2页1.一种重组轮状病毒VP6载体蛋白的构建方法，其特征在于通过下列步骤：1）根据轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白基因的核苷酸序列，人工设计下列引物对：P174F：CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG；P174R：CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA；P197F：GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT；P197R：TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC；P244F：GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA；P244R；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC；P275F：GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA；P275R：AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT；P298F：AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA；P298R：GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA；P308F：GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA；P308R：ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG；以及下列引物：PETL5：ATCATATGGAGGTTCTGTACTC；PVP6-3：TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT；2）以轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白编码基因为模板，以下列为引物对，进行PCR扩增：PETL5/P174R和P174F/PVP6-3；PETL5/P197R和P197F/PVP6-3；PETL5/P244R和P244F/PVP6-3；PETL5/P275R和P275F/PVP6-3；PETL5/P298R和P298F/PVP6-3；PETL5/P308R和P308F/PVP6-3；PCR扩增反应体系为：PCR反应混合液体积为100μl，其中，分别含有60pmol的上述各引物对，以及30ng模板DNA，1×105pmol的dNTPs，10μl的10×PCR缓冲液，5UTaqDNA聚合酶，其余用水补足；PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性40s，56℃复性30s，72℃延伸反应1min，共40个循环，最后72℃延伸10min；分别得到：带有SacI位点序列的PCR扩增片段：6174F和6174R；带有BspT104I位点序列的PCR扩增片段：6197F和6197R；带有KpnI位点序列的PCR扩增片段：6244F和6624R；带有BlnI位点序列的PCR扩增片段：6275F和6275R；带有SacII位点序列的PCR扩增片段：6298F和6298R；带有XhoI位点序列的PCR扩增片段：6308F和6308R；用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化上述六对扩增片段；3）将步骤2）所得下列各扩增片段，按常规分别用下列对应的内切酶即内切酶I/内切酶II进行双酶切：带有SacI位点序列的PCR扩增片段6174F：NdeI/SacI；带有SacI位点序列的PCR扩增片段6174R：SacI/BamHI；2CN102643335B权利要求书2/2页带有BspT104I位点序列的