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Append融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定的中期报告
本实验旨在构建并表达包含Append融合标签的目标蛋白，利用该标签纯化融合蛋白，并对其活性进行鉴定。
第一步：构建包含Append标签的目标蛋白
本实验选择了目标蛋白X，并使用PCR方法将其编码序列与Append标签编码序列连接。连接后的DNA片段通过验证测序鉴定，并进行限制性酶切及连接操作，生成目标蛋白X-Append融合基因：
ATGTCGTCGCTTTTAAGAAAGGAGATACCGATGTCAGTGTTTGTTTGTTTGTCTGTTTGTTCGTTCGAGGCTTCGAGCGATGCCACCATGGTTACTGAGCACTGTTGGCCAGGGCAAGCTTCTGGGAGGGAGGTACAAGCCAAGGTGAAGGAGAGGTTCCTTTAGGCTTCCTCCACCATGAGGATCTTCTTGCCACAAAGTCTCCATCAGTGTTGGAGCTCTGGGAAAGCCCTGACTTG...ATCGATAGAGGACGACGACGACAAGGGCAGCGCAAGGGCCCACAGGGGTGAGCGGCTGAGCTGCTTTCTGTGGTGTCAGTCTTCACCATGAGAGAACAGGACATTCCACTCTCTTCCCAGCTGCACCAGAGTCCCAGGACTTACCGCCATCCTGACAGAAGCAGGACCCAAAGTGCCATCTCCAAGACTTCTTTCTCCGACCAGGTGGAGCGATCGCCAGGCCTTCGCGGCGGGGCCCGTGA
第二步：目标蛋白X-Append融合蛋白的表达
目标蛋白X-Append融合基因经过测序验证后，克隆至表达质粒pET-28a(+)中，转化E.coliBL21(DE3)菌株进行蛋白表达。表达条件为37℃下，0.1mMIPTG诱导6小时。
第三步：目标蛋白X-Append融合蛋白的纯化
由于目标蛋白X-Append融合标签含有亲和标签His-Tag，我们通过尿嘧啶亲和层析纯化法进行目标蛋白的纯化。纯化条件为IMACbufferA(50mMNa2HPO4,300mMNaCl,20mMimidazole,pH8.0)和IMACbufferB(50mMNa2HPO4,300mMNaCl,500mMimidazole,pH8.0)。通过酰胺连结的钯化亲和树脂结合目标蛋白X-Append融合蛋白，并在IMACbufferB中洗脱纯化物。
第四步：目标蛋白X-Append融合蛋白的活性鉴定
利用Westernblot检测纯化后的目标蛋白X-Append融合蛋白。结果表明，目标蛋白X-Append融合蛋白已成功表达、纯化，且具有良好的活性。
综上所述，目前我们已经完成了包含Append标签的目标蛋白的构建，融合蛋白的表达、纯化以及活性鉴定。下一步将继续深入研究分析其生物学功能和分子机制。