基因突变多重检测用引物组合物及其试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112824535A(43)申请公布日2021.05.21(21)申请号201911146751.3(22)申请日2019.11.21(71)申请人迈克生物股份有限公司地址611731四川省成都市高新区百川路16号(72)发明人葛志琪赵雨航李锦(51)Int.Cl.C12Q1/6851(2018.01)C12Q1/6886(2018.01)C12Q1/6876(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书16页序列表4页附图7页(54)发明名称基因突变多重检测用引物组合物及其试剂盒(57)摘要本发明公开一种基因突变多重检测用引物组合物及其试剂盒；该引物组合物包括第二上游引物、探针、下游引物和至少两条不同的第一上游引物；其中，第一上游引物包括上游检测区和靶序列结合区：上游检测区有与第二上游引物具有相同序列的(a)部分，以及与探针具有相同序列的(b)部分；靶序列结合区的3’端具有扩增决定位点，该扩增决定位点与突变型靶序列上的变异检测位点互补，且其上游具有由一个或多个碱基组成的不与靶序列互补的错配区；不同的第一上游引物为靶序列结合区不同。本发明的引物组合物还包括野生型阻断剂。使用上述引物组合物或试剂盒检测多重基因突变，可提高检测灵敏度、特异性，减低检测成本；并且检测的准备度更高。CN112824535ACN112824535A权利要求书1/1页1.基因突变多重检测用引物组合物，其特征在于：该引物组合物包括第二上游引物、探针、下游引物和至少两条不同的第一上游引物；其中，所述第一上游引物从5’端至3’端依次包括上游检测区和靶序列结合区：(1)上游检测区从5’端至3’端包括：与第二上游引物具有相同序列的(a)部分，以及与探针具有相同序列的(b)部分，及(2)靶序列结合区的3’端具有扩增决定位点，所述扩增决定位点与突变型靶序列上的变异检测位点互补，且扩增决定位点的上游具有由一个或多个碱基组成的不与靶序列互补的错配区；所述不同的第一上游引物为靶序列结合区不同；第二上游引物不与靶序列和第一上游引物配对。2.根据权利要求1所述的基因突变多重检测用引物组合物，其特征在于：所述不同的第一上游引物上，所述靶序列结合区不同，所述上游检测区的(a)部分相同或不同，所述上游检测区的(b)部分相同；优选地，所述不同的第一上游引物上，所述靶序列结合区和所述上游检测区的(a)部分均不相同。3.根据权利要求2所述的基因突变多重检测用引物组合物，其特征在于：该引物组合物还包括野生型阻断剂；所述野生型阻断剂的Tm值≥第一上游引物的Tm值＞第二上游引物的Tm值。4.根据权利要求1～3任一项所述的基因突变多重检测用引物组合物，其特征在于：所述下游引物与靶序列上互补配对的位置设置在变异检测位点下游的1～150bp处。5.根据权利要求1～4任一项所述的基因突变多重检测用引物组合物，其特征在于：所述第一上游引物上靶序列结合区中错配区的长度为1～15个碱基；所述第一上游引物上扩增决定位点与错配区距离为1～15个碱基。6.一种基因突变多重检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括权利要求1～5任一项所述的引物组合物。7.一种EGFR基因19外显子突变检测用引物组合物，其特征在于：该引物组合物包括：第一上游引物SEQIDNO:15、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6；第二上游引物SEQIDNO:9；探针SEQIDNO:10；下游引物SEQIDNO:11。8.一种EGFR基因19外显子突变检测用引物组合物，其特征在于：该引物组合物包括：第一上游引物SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6；第二上游引物SEQIDNO:8、SEQIDNO:9；探针SEQIDNO:10；下游引物SEQIDNO:11。9.根据权利要求8或9所述的EGFR基因19外显子突变检测用引物组合物，其特征在于该引物组合物还包括野生型阻断剂；优选地，所述野生型阻断剂为寡核苷酸SEQIDNO:7。10.权利要求7或9的引物组合物在制备EGFR基因19外显子突变检测试剂盒的应用。2CN112824535A说明书1/16页基因突变多重检测用引物组合物及其试剂盒技术领域[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基因多重突变检测用的数字PCR引物组合物及其试剂盒。背景技术[0002]数字PCR(digitalPCR,dPCR)技术是一种核酸分子绝对定量技术，利用极限稀释的原理将一个荧光定量PCR反应体系分配到成千上万份单独的纳升级微反应器中，使得每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的