一种埃坡霉素高产菌株选育方法及菌株.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109306348A(43)申请公布日2019.02.05(21)申请号201811308837.7(22)申请日2018.11.05(71)申请人湖南迪诺制药股份有限公司地址410000湖南省长沙市浏阳经济技术开发区康平路165号(72)发明人易志恒丁小军潘琳(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人罗满(51)Int.Cl.C12N15/03(2006.01)C12N1/21(2006.01)C12R1/01(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图2页(54)发明名称一种埃坡霉素高产菌株选育方法及菌株(57)摘要本申请公开了一种埃坡霉素高产菌株的选育方法。本申请还提供一种使用上述方法获得的埃坡霉素高产菌株。本申请提供埃坡霉素高产菌株的选育方法，通过采用Genomeshuffling技术，将纤维堆囊菌以诱变获得的菌株作为出发株，然后通过多轮递归原生质体融合的方式，将不同亲本的优良性状高效地整合到融合子中，然后借助高通量筛选的方法获得性状显著改良的突变株。本申请提供的选育方法，简便、高效，耗时短，并能得到埃坡霉素产量显著提高的菌株。CN109306348ACN109306348A权利要求书1/2页1.一种埃坡霉素高产菌株的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：a、取纯培养纤维堆囊菌，接种在CNST培养基上活化，然后转移至M26培养基培养至指数期，收集菌体；b、使用溶菌酶处理菌体，获得原生质体；将原生质体分为两份，第一份原生质体热灭活，第二份原生质体紫外灭活，然后将两份灭活后的原生质体融合，使用VY/2培养基再生培养，得到第一代菌株；c、将第一代菌株中部分进行诱变，将诱变后的菌株与未诱变的菌株使用溶菌酶处理，获得原生质体，然后将原生质体分为两份，第一份原生质体热灭活，第二份原生质体紫外灭活，然后将两份灭活后的原生质体融合，使用VY/2培养基再生培养，得到第二代菌株；d、重复步骤c1-3次，将每次获得的菌株分别收集、培养，筛选获得高产菌株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中，所述CNST培养基的配方为Na2HPO4·12H2O0.025％，KNO30.05％，MgSO4·7H2O0.1％，微量元素液1mL/L，琼脂2.0％，pH7.2；和/或，所述纤维堆囊菌在所述CNST培养基上28-30℃加湿培养5-10天。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中，所述M26培养基的配方为：土豆淀粉0.8％，豆蛋白胨0.2％，葡萄糖0.2％，酵母粉0.2％，MgSO4·7H2O0.1％，CaCL20.1％，EDTA-Fe3+1mL/L，pH7.2；和/或，所述纤维堆囊菌在所述M26培养基中150-250rpm/min摇床28-30℃培养3-6天。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述纤维堆囊菌经M26培养基培养至指数期后，搅拌打散培养液中菌体，然后接种到新的M26培养基中，150-250rpm/min摇床28-30℃继续培养2-3天，收集菌体，进入步骤b中使用。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b或步骤c中，使用溶菌酶处理菌体具体为：将菌体的浓度调整为1*108cell/ml，悬浮在MMM缓冲液中，再加入等体积的浓度为2mg/ml溶菌酶液，混匀，30℃水浴保温25-40min，离心，收集原生质体，用MMM缓冲液洗涤并重悬，获得原生质体悬液；所述MMM缓冲液由甘露醇、氯化镁、马来酸配成。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述菌体在使用溶菌酶处理前，先加入EDTA预处理10-20min。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b或步骤c中，所述热灭活具体为在60-80℃下水浴1-10min；和/或，所述紫外灭活具体为：将原生质体置于平皿中，25-40w的紫外灯在平皿上方30-40cm高度照射60-300s。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b或步骤c中，所述VY/2培养基的配方为：活性干酵母0.5％，VB120.5mg/L，MgSO4·7H2O0.05％，CaCL20.1％，琼脂2.0％，pH7.2；和/或，所述原生质体在所述VY/2培养基上30℃恒温培养5-10天，直至长出单菌落。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中，所述收集、培养、筛选具体为：将每次获得的菌株再生培养，获得再生菌落，检测再生菌落250nm波长的吸光度，取吸光度最高的1-10株菌株进行发酵培养，HPLC定量检测埃坡霉素含量，最终筛选得到埃坡霉素高产菌株。2CN109306348A权利要求书2/2页10.一株埃坡霉素高产菌株，其特征在于，由权利要求1-9中任一项所述的方法获得。3CN