一种达托霉素高产菌株及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113717909A(43)申请公布日2021.11.30(21)申请号202010456478.0(51)Int.Cl.(22)申请日2020.05.26C12N1/21(2006.01)C12N15/76(2006.01)(83)生物保藏信息C07K7/08(2006.01)CGMCCNo.182972019.07.26C12P21/02(2006.01)(71)申请人杭州中美华东制药有限公司C12R1/465(2006.01)地址310011浙江省杭州市拱墅区莫干山路866号申请人浙江工业大学(72)发明人吴杰群张薇平丽英沈建宇杨永梅方丽纳徐金勇吴金荣范萍吴骏(74)专利代理机构北京领科知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11690代理人张丹杨晞权利要求书1页说明书5页序列表1页附图3页(54)发明名称一种达托霉素高产菌株及其应用(57)摘要本发明涉及了一种达托霉素高产菌株及其制备方法，重组菌株的分类命名为玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)，保藏号为NO.CGMCC18297。本发明通过使用全局调控因子CRP，解决了传统链霉菌育种的高工作量，高盲目性的问题，得到了利用基因工程培育的达托霉素高产菌株，应用前景广阔；利用该方法对出发菌玫瑰孢链霉菌进行改造，得到的重组菌株能提高玫瑰孢链霉菌对癸酸的耐受度、癸酸利用率，以及提高达托霉素的产量。CN113717909ACN113717909A权利要求书1/1页1.一种高产达托霉素的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的分类命名为玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)，所述重组菌株的保藏号为NO.CGMCC18297。2.根据权利要求1所述的高产达托霉素的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为癸酸耐受菌株。3.根据权利要求3所述的高产达托霉素的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的癸酸耐受度为出发菌株的两倍。4.权利要求1-3任一项所述的高产达托霉素的重组菌株构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)获取SEQIDNO.1所示的编码CRP蛋白的调控基因；2)将所述调控基因与表达载体连接，构建重组质粒；3)将所述重组质粒导入玫瑰孢链霉菌株，得到重组菌株。5.根据权利要求4所述的高产达托霉素的重组菌株构建方法，其特征在于，所述步骤1)优选为从玫瑰孢链霉菌中获取SEQIDNO.1所示的编码CRP蛋白的调控基因；所述步骤2)优选为将CRP蛋白的调控基因克隆到含强启动子的表达载体PSET152上，得到含CRP基因的重组质粒，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述步骤3)优选为通过接合转移的方法，将步骤(2)得到的重组质粒转移到玫瑰孢链霉菌中，获得重组菌株。6.根据权利要求4所述的高产达托霉素的重组菌株，其特征在于，通过将步骤3)得到的重组菌株进行抗生素筛选，发酵培养及达托霉素效价测定，获得达托霉素高产的链霉菌菌株。7.权利要求1-3任一项所述的重组菌株在发酵生产达托霉素中的应用。8.权利要求1-3任一项所述的重组菌株在提高玫瑰孢链霉菌对癸酸的耐受度、利用率及提高达托霉素发酵产量中的应用。2CN113717909A说明书1/5页一种达托霉素高产菌株及其应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种达托霉素高产菌株及其制备方法。背景技术[0002]达托霉素是由玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)产生的一种新型的环脂肽抗生素，是以钙离子依赖的方式与细胞膜相互作用并发挥杀菌活性。2010年12月,美国FDA批准了Cubist制药有限公司的达托霉素(daptomycin)注射剂Cubicin以一日1次2min静脉内推注用新给药方案。Cubicin在美最早于2003年获得批准,用于一日1次30min静脉内输注给药治疗由某些革兰阳性菌、包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的复杂性皮肤和皮肤组织感染,2006年又获得了治疗由对甲氧西林敏感和耐药的金黄色葡萄球菌引起的菌血症、包括右心感染性心内膜炎的新适应证，被视为万古霉素的最佳替代品。我国食品药品监督管理总局分别于2015年和2016年批准了杭州中美华东制药有限公司，浙江海正药业股份有限公司和江苏恒瑞医药股份有限公司生产的注射用达托霉素。多项研究表明达托霉素上市10多年来耐药比例并未显著提高，彰显出达托霉素的独特优势。[0003]达托霉素是一种微生物次级代谢产物，结构复杂，产量非常低，通过基因工程改造是提高达托霉素产量、降低生产成本的重要策略。[0004]癸酸是达托霉素合成中的外源性前体，可改变菌体的次级代谢方向。在达托霉素的生产中，癸酸是必需物质，但过量的癸酸会对玫瑰孢链霉菌产生毒性；