一种多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107287184A(43)申请公布日2017.10.24(21)申请号201710564816.0C12R1/465(2006.01)(22)申请日2017.07.12(71)申请人乳山韩威生物科技有限公司地址264599山东省威海市乳山市青山路306号申请人青岛中科青石生物科技有限公司(72)发明人李盛英杜磊马圆圆徐晓庆王玉亭(74)专利代理机构北京怡丰知识产权代理有限公司11293代理人于振强(51)Int.Cl.C12N13/00(2006.01)C12N1/20(2006.01)C12N1/02(2006.01)权利要求书2页说明书5页附图3页(54)发明名称一种多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法(57)摘要本发明涉及一种多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法，其解决了现有菌株多氧霉素I组分含量较低的技术问题，本发明的出发菌株为圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)，该方法包括配制出发菌株孢子悬液，将稀释后的孢子悬液经过紫外诱变后，涂布于含有5-氟尿嘧啶抗性平板，培养后，对抗性菌株筛选得到多氧霉素I组分高产菌株。本发明筛选的多氧霉素I组分(polyoxinI)高产菌株，其发酵液对烟草赤星菌具有抑制作用。本发明的筛选方法可以快速地筛选出高产菌株。CN107287184ACN107287184A权利要求书1/2页1.一种多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法，其特征是包括以下步骤：步骤1、将多氧霉素出发菌株圈卷产色链霉菌野生型P0接种于斜面培养基恒温培养，所述斜面培养基包括以下成份，单位为g/L：可溶性淀粉：15～25；KNO3：0.8～1.2；K2HPO4：0.3～0.8；MgSO4·7H2O：0.3～0.8；NaCl：0.3～0.8；FeSO4·7H2O：0.008～0.012；琼脂：15～25；步骤2、挑选步骤1培养的孢子，并加入生理盐水，制成孢子悬液；步骤3、按步骤1所述培养基配制不同浓度的5-氟尿嘧啶的孢子培养基，5-氟尿嘧啶浓度，分别为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1，单位为g/L；步骤4、将步骤1所述的野生型菌株P0作为出发菌株，分别涂布于步骤3所述的不同浓度的5-氟尿嘧啶孢子培养基，恒温培养；步骤5、根据步骤4所述的孢子生长情况，选择3种不同浓度的5-氟尿嘧啶孢子培养基，其浓度分别为0.1、0.3、1，单位为g/L；步骤6、将步骤2所述的孢子悬液稀释，取3～5mL稀释后的孢子悬液置于无菌平板中，放置于紫外诱变箱中进行照射；步骤7、将步骤6所述的无菌平板取出，将其上的孢子悬液稀释，并分别涂布于步骤5所述的3种不同浓度的5-氟尿嘧啶孢子培养基，恒温培养；步骤8、挑选步骤7培养的突变后的单菌落，接种于步骤1所述的斜面培养基，恒温培养；步骤9、将步骤8培养的菌落接种到种子培养基，恒温培养，所述种子培养基包括以下成份，单位为g/L：酵母提取物：8～12；胰蛋白胨：12～18；KNO3：0.8～1.2；K2HPO4：0.3～0.8；MgSO4·7H2O：0.3～0.8；NaCl：0.3～0.8；FeSO4·7H2O：0.008～0.012；步骤10、将步骤9培养的菌落按菌落与发酵培养基体积百分比8～12％的接种量接种到发酵培养基进行摇瓶发酵，同时以步骤4所述的出发菌株做对照，所述发酵培养基包括以下成份，单位为g/L：淀粉：40～60；豆粕粉：20～28；酵母提取物：3～8；甘露醇：3～8；NaCl：3～8；NH4SO4：0.3～0.8；CaCO3：1～5；步骤11、对步骤10的发酵产物中多氧霉素组分变化进行检测，筛选与出发菌株P0次级代谢组分有差异的菌株；步骤12、对步骤11筛选的菌株进行检测，筛选出多氧霉素I组分高产菌株。2.根据权利要求1所述的多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤1中斜面培养基包括以下成份，单位为g/L：可溶性淀粉：20；KNO3：1；K2HPO4：0.5；MgSO4·7H2O：0.5；NaCl：0.5；FeSO4·7H2O：0.01；琼脂：20；所述斜面培养基的pH值为7.0。3.根据权利要求1所述的多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤9中，种子培养基包括以下成份，单位g/L：酵母提取物：10；胰蛋白胨：16；KNO3：1；K2HPO4：0.5；MgSO4·7H2O：0.5；NaCl：0.5；FeSO4·7H2O：0.01；所述种子培养基的pH值为7.0。4.根据权利要求1所述的多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤10中，发酵培养基包括以下成份，单位为g/L：淀粉：50；豆粕粉：25；酵母提取物：5；甘露醇：5；N